Укр лит 7 клас авраменко: Підручник Українська література 7 клас Авраменко 2015

В этот день мама Александра рассказала нам еще кое-что о своем сыне: в прошлом году, летя домой в Украину, он сделал пересадку в Нидерландах.

«Он знает, что я люблю цветы. У него было свободное время, и он купил мне семена тюльпанов», — объяснила она. «Сажал прошлой осенью, а в этом году 10 из 10 — все зацвели».

Они расцвели именно в День матери, сказала она, примерно через два месяца после смерти Александра.

Звук для этого рассказа продюсировала Моника Евстатьева; под редакцией Барри Хардимона и Роберта Литтла; цифровое производство Мэг Андерсон; исследование Барбары Ван Вурком; обработка фотографий Эмили Богл; визуальные эффекты и графическое редактирование Ника Макмиллана и Ника Андервуда. Лука Олексишин, Росс Пелех, Евгений Афанасьев, Марк Рачкевич и Юлиан Хайда предоставили отчеты, переводы и помощь в исследованиях.

Copyright 2022 NPR. Чтобы увидеть больше, посетите https://www.npr.org.

Шоумен и украинское дело – University of Manitoba Press

Народный танец, кино и жизнь Василия Авраменко

Орест Т. Мартынович (автор)

Дон-донкихотский и изменчивый Василий Авраменко (1895–1981) использовал фольклор танец и кино в крестовом походе длиною в жизнь, чтобы продвигать борьбу Украины за независимость среди североамериканских зрителей. Энергичный и харизматичный, но также манипулятивный, непрактичный и тщеславный, он десятилетиями был неоднозначной фигурой.

Родившийся в селе под Киевом, Авраменко зарекомендовал себя как артист и учитель танцев среди украинских эмигрантов в Центральной Европе. Он иммигрировал в Канаду в 1925 году и организовал сеть школ украинского народного танца, апеллируя к патриотизму новых иммигрантов и их стремлению к культурному выживанию. Будучи преисполнен решимости покорить Бродвей, он переехал в Нью-Йорк в 1929 году, руководил своей расширяющейся сетью танцевальных школ и начал ставить сложные (убыточные) танцевальные и музыкальные представления.

К середине 1930-х годов бурная деятельность Авраменко распространилась на кинопроизводство. Он призвал к созданию «украинского Голливуда» и выпросил и занял достаточно денег, чтобы снять два художественных фильма с режиссером Эдгаром Г. Ульмером, «королем этнических фильмов и фильмов категории B». После Второй мировой войны карьера Авраменко пошла на спад, и последние десятилетия он провел в путешествиях по Австралии и Израилю в бесплодных попытках привлечь спонсоров для финансирования его танцевальных представлений.

Основано на обширных оригинальных исследованиях, Шоумен и украинское дело дает яркую картину того, как культура и политика могут пересекаться в сообществе диаспоры.

Награды

• ФИНАЛИСТ литературной премии имени Кобзаря (2016 г.)
• ПОБЕДИТЕЛЬ премии «День Манитобы», Ассоциация архивов Манитобы (2016 г.)

Отзывы

«Эта книга стоит особняком от других исследований украинцев в Канаде и США тем, что выходит за рамки политики, организаций и церквей украинской общины. Через свою биографию Василе Авраменко Мартынович исследует страсти простых людей, которые пытались вписаться в североамериканский культурный ландшафт».

– Богдан Я. Небесио, Университет Брока, Восток/Запад: Журнал украинских исследований

«Мартынович — выдающийся исследователь, и Авраменко, будучи так влюблен в себя и в свою миссию, оставил огромный архив. Используя это, наряду с другими данными, автор предоставил столь необходимую книгу о человеке, который помог сформировать украинское культурное самовыражение на Западе».

– Наталья Кононенко, Университет Альберты, 9 лет0513 Славянский и восточноевропейский журнал

«Хорошо написанная, тщательно проработанная и здраво критическая биография выдающегося шоумена, танцмейстера, режиссера, культурного деятеля и незаурядной личности Василия Авраменко (1895–1981), сделавшего себе имя в украинских общинах Украины. Канада и США в межвоенный и послевоенный период».

– Светлана (Лана) Крыс, Университет Макьюэна, Canadian Journal of History

«Восхитительная и тщательно проработанная история малоизвестной украинской личности Василия Авраменко, которая оставила свой след как в шоу-бизнесе, так и в украинском сообществе в целом. Мартынович не останавливается исключительно, но помещает его в исторический и географический контекст на каждом этапе его увлекательной жизни. Образцовая биография».

– Рэймонд Хеберт, Надин Маккензи и Ной Рихлер, судьи, премия Александра Кеннеди Исбистера за документальную литературу, 2015 Manitoba Book Awards.

«Мартынович создал хорошо сбалансированное произведение, но, что более важно, это единственный источник, в котором Василий Авраменко изображен без сильно приукрашенного каркаса. Мартынович развенчивает национальный миф, тщательно взращенный в его собственном сообществе, и можно только удивляться тому риску, на который пошел он и издательство University of Manitoba Press, опубликовав его. Хотя некоторые читатели могут быть шокированы, узнав, что танцмейстер был всего лишь скромно талантливым хореографом (согласно более поздним ожиданиям выступления) и заблуждающимся, завистливым и эгоистичным персонажем, я считаю, что эта публикация также делает Авраменко более реальным и более человечным. ”

– Дженнифер Бойвин, Университет Садбери, обзоры H-Net.

«В ходе создания этой прекрасной небольшой монографии об Авраменко Мартынович также предоставил читателям блестящий небольшой учебник по политике украинской диаспоры, украинскому добровольчеству в Северной Америке, изменяющемуся характеру диаспорного сообщества с годами и, возможно, наиболее как ни странно, в популярной культуре Северной Америки 1920-х и 1930-х годов. Неплохое достижение для 155 страниц».

– Джим Мочорук, Университет Северной Дакоты, История Манитобы

“ Шоумен и украинское дело – это потрясающая новая книга Ореста Т. Мартыновича, сочетающая в себе тщательную исследовательскую работу с навязчивым стилем прозы, умело излагающая превосходную научно-популярную литературу, подробно описывающую жизнь и карьеру дальновидного безумца, посвященного поддерживать и продвигать украинскую культуру во всем мире, несмотря на ее репрессии как при коммунизме, так и на крайне жесткую политику русификации в постреволюционной Украине, где доминировали советские власти».

– Грег Климкив, The Film Corner

«Мартынович прекрасно умеет рассказывать историю жизни, которая увлекательна для чтения и очень убедительна. Авраменко был пионером монументального значения, однако его история не соответствует архетипу украинского иммигранта. Это поучительный текст для всех, кто интересуется изучением народного танца и культурной продукции, и незаменим для тех, кто занимается украиноведением».

– Марсия Осташевски, кафедра истории и культуры Кейп-Бретонского университета.

“ Шоумен и украинское дело будет интересен многим жителям Манитобы, в том числе тем, кто научился украинским танцам у Авраменко или его первых учеников, тем, кто снимался в его фильмах, и тем, кто потерял свои деньги, вкладываясь в его проекты . […] Некоторые читатели, помнящие Авраменко, могут задаться вопросом, почему Мартынович «запятнал» репутацию великого человека. Но автор просто излагает правду хорошо задокументированной жизни — решать читателю. Теперь мы знаем о человеке в целом, а не только о персоне».

– Orysia Tracz, Winnipeg Free Press

«Василий Авраменко сегодня имеет легендарный статус импресарио и популяризатора украинского танца. […] Это исследование является незаменимым чтением для понимания того, как популярные формы искусства развивались в Северной Америке, особенно для того, чтобы увидеть, как местное и «этническое» пересекалось с коммерческим и «мейнстримом».

– Мирослав Шкандрий, Украина, вс

«Историкам иммиграции и Восточной Европы в целом будет полезен взгляд на межвоенную жизнь украинских иммигрантов, который можно получить, заглянув через плечо динамичного и вездесущего Авраменко. Это сочувственное исследование также проливает свет на культурное потребление и аккультурацию иммигрантов в Северной Америке в тот период».

– Розамунд Джонстон, Нью-Йоркский университет, , Гарвард, Украинские исследования, .

Об авторе

Орест Т. Мартынович — историк Центра украинско-канадских исследований Университета Манитобы. Он является автором книги украинцев в Канаде: годы становления, 1891-1924 .

Информация о книге

• Шоумен и украинское дело: народный танец, кино и жизнь Василия Авраменко
• Мартынович Орест Т. (Автор)
• Опубликовано в октябре 2014 г., 248 страниц
• Бумага, ISBN: 978-088755-768-2, 6 × 9, 27,95 долл. США
• Рубрики: Биография, Этноведение, История, Иммиграция, Музыка
• Часть серии U of M Press: Исследования в области иммиграции и культуры

Купить онлайн

• Бумага (27,95 долларов США)
• электронная книга — формат EPUB (25,00 долларов США)
  Скидка в Интернете: 20,00 долларов США
• электронная книга — формат PDF ($25.00)
  Интернет-скидка: $20.00

Похожие заголовки

Преображающееся паломничество: Андрей Авраменко — Колледж Сарум

Сентябрь 2022

В прошлом месяце я вернулся из учебного паломничества в Святую Землю вместе с несколькими другими выпускниками и посвященными в Сарум-колледж и за его пределами, любезно предоставленными Британским региональным комитетом колледжа Святого Георгия в Иерусалиме. Каждые два года они предлагают сильно субсидируемые паломничества, чтобы обогатить служение тех, кто вступает в рукоположенное служение в англиканской общине — благословляя студентов благословлять общины и не только.

Нашей базой были колледж и собор Святого Георгия, место спокойствия в нескольких минутах ходьбы от шумных улиц Старого города. Оттуда нас повезли, чтобы начать наше паломничество традиционным способом с посещения Храма Гроба Господня — храма, построенного на месте распятия, погребения и воскресения Христа и вокруг него.

Приближение к Гробу Господню дает представление о многоконфессиональных аспектах жизни в Иерусалиме, когда пути иудаизма, ислама и христианства пересекаются друг с другом на узких и многолюдных улицах старого города. Это также дало представление о многоконфессиональных аспектах христианского богослужения на Святой Земле, с пространством как внутри, так и за пределами Гроба Господня, курируемым христианами со всего мира. Столкновение с многочисленными способами благодарить за жертву и спасение Иисуса раскрывает вызов и благословение живого разнообразия. Этот опыт напоминает нам, что благодаря Иисусу различия могут не просто сосуществовать, но сотрудничать и прославлять нашу уникальность.

Разнообразие Гроба Господня отражалось в том, как студенты и сотрудники реагировали на разные места. То, что вызвало глубокую встречу для одного, не всегда воспламеняло воображение другого. Я, например, изо всех сил пытался заняться гробницей Христа из-за того, что живой камень был спрятан под мраморным фасадом и наполнен иконами и золотом; но был доведен до слез простотой камня, на котором, как считалось, было помазано тело Христа перед погребением. Для некоторых было верно обратное — не было единого способа встречи каждого присутствующего с Богом. Обмен нашими различными реакциями и размышлениями на протяжении нашего совместного пребывания в Израиле и Палестине сам по себе стал обогащающим опытом, который расширил наше собственное понимание традиций в Теле Христовом.

Как и во многих других паломничествах на Святую Землю, во время нашего пребывания там мы путешествовали по земле, вызывающей сильные реакции, будь то духовные или физические, политические или культурные. Это было продемонстрировано не более ясно, чем когда, благодаря работе и добросовестности сотрудников колледжа Святого Георгия, нам была предоставлена ​​​​экскурсия в Аль-Харем аш-Шариф; также известная как Храмовая гора — это место Второго еврейского храма, разрушенного в 70 году нашей эры. Окна мечети, поврежденные обстрелом из Еврейского квартала, и присутствие ортодоксальных евреев, сопровождаемых вокруг священного места вооруженными автоматами солдатами из Израиля, показали нам напряженность между иудаизмом и исламом на священных для них землях и христианам. Мы встретились с представителями Мусалахи, организации, которая стремится сделать именно это: следовать надежде на мир в Израиле и Палестине, помогая примирить тех, кто разделен верой, подозрительностью и политикой. В церкви Pater Nostra размещение молитвы «Отче наш» на украинском языке в том же месте, что и русская версия, давало надежду на мир в конфликтах в более отдаленных районах.

Подобно политическому накалу, физический накал связывал наше воображение с реальностью жизни, описанной в Библии. В нашем автобусе с кондиционером мы путешествовали по разным местам с комфортом, который резко контрастировал с тем, что мы чувствовали бы, путешествуя по ландшафтам, залитым солнцем пустыни. Это оживило вызов жизни и путешествия, который Иисус, ученики и другие испытали бы в лучшем случае на осле, чтобы перемещаться по каменистой местности между безопасными убежищами. Мы еще глубже соединились с библейским опытом через воды, в которых Иисус провел время, на них и рядом с ними. Подтверждение моих обетов крещения в реке Иордан, в районе, где Иоанн Креститель крестил Иисуса, было глубоким опытом, который я надеюсь распространить на других через воду, которую я принес домой, чтобы влить в воду крещения, которую я буду председательствовать. закончится в будущем. Еще одним ярким событием было стояние среди археологических остатков Вифсаиды, где мой тезка, ученик Андрей, жил и ушел, чтобы следовать за Иисусом. Именно среди таких природных пространств я наиболее глубоко соединился с реальностью того, что описывает Библия, лишенной того, что омрачало мою способность видеть то, что когда-то было.

Можно посетить Святую землю и остаться изолированным в своих традициях, вере и политических взглядах, но это учебное паломничество поставило перед нами задачу сделать обратное и позволить этому месту изменить нас. Паломничество оживило Священное Писание интуитивно, и я надеюсь, что оно так же обогатит других, когда я проповедую и служу в свете своего опыта.

Если у вас есть возможность посетить Израиль и Палестину, я призываю вас сделать это, и сделать это вместе с Колледжем Святого Георгия, поскольку их стипендия и любовь к этому месту не имеют себе равных. Они не просто организуют гостеприимные паломничества в течение всего года, но их работа является практическим примером поиска примирения и мира, к чему призывает нас Иисус. Это гостевой дом, колледж и собор, за которые нужно молиться, но не только за работу, которую они выполняют в Израиле и Палестине. Являясь частью Иерусалимской и Ближневосточной епархии, Колледж Святого Георгия является благословением и миром, которым нужно делиться далеко за пределами своих границ.

Выражаю благодарность Британскому региональному комитету колледжа Святого Георгия в Иерусалиме за их поддержку и благословение.

Преподобный Андрей Авраменко является викарием в бенефисе Чарлкомб с Батом Св. Стефана, входящей в епархию Бата и Уэллса. Он получил степень по богословию, служению и миссии в колледже Сарум в 2020 году и был рукоположен в священники в Уэллсском соборе в июне 2021 года.

Прочитайте размышления о паломничестве от Преподобного Лизы Родригес

Защитники украинских городов-побратимов, вооруженные, но дерзкие, готовые к нападению России 2022. REUTERS/Gleb Garanich REUTERS/Gleb Garanich

КРАМАТОРСК/СЛОВЯНСК, Украина, 7 июля (Рейтер) — В восточноукраинском городе Краматорск механик, ставший солдатом, Арчк помогает укрепить оборону от неминуемой атаки России, в то время как поблизости Фермер Василий Авраменко сетует на потерю урожая, вытесненного шахтами.

Снаряды непрерывно обрушиваются на Краматорск и его близнеца, Славянск, и они готовы стать следующей линией фронта в наступлении Москвы на промышленно развитом Донбассе. подробнее

Их защитники вооружены меньше, но украинцы и раньше отражали здесь пророссийские силы, города были захвачены прокремлевскими сепаратистами в апреле 2014 года и отбиты через три месяца.

«Конечно, мы уже готовы. Мы готовы», — сказал Рейтер Арчк, назвавшись псевдонимом.

«Это их (российских) фантазии оккупировать эти города, но они не ожидают такого уровня сопротивления — не только украинское правительство, но и люди отказываются их принимать.»

Последние обновления. статья с галереей

Посмотреть еще 2 истории

Их улицы жутко пустынны, поскольку экскаваторы копают окопы на окраинах, чтобы предотвратить продвижение российских танков. Города имеют огромное символическое значение для Москвы, которая считает их колыбелью сепаратистского повстанческого движения. он поддерживал в 2014 году.

Когда-то центры советской машиностроительной промышленности, они расположены в Донецкой области и полностью находятся под прицелом России после того, как силы Кремля установили контроль над соседней Луганской областью — также частью Донбасса — в минувшие выходные.

Во вторник, когда вдалеке раздались звуки приближающихся снарядов, губернатор Донецкой области Павел Кириленко сообщил журналистам, что готовится к эвакуации из обоих городов.

Военные аналитики говорят, что Украина могла бы лучше защищать свою новую линию фронта после того, как ее войска отступили из котла, который они защищали в течение нескольких месяцев, в котором Россия могла обстреливать их артиллерией с трех сторон.

Украинские солдаты в отрыве от линии фронта, расположенной всего в 10 км (шести милях) от Славянска, заявили, что они значительно уступают в вооружении, и призвали страны Запада доставить им больше высокотехнологичного тяжелого вооружения и боеприпасов.

«Мы стреляем один раз, а они отвечают кассетными бомбами», — сказал один артиллерист, отказавшийся назвать свое имя.

«У русских так много снарядов, а они просто бьют в ту область. Они не считают, по чему стреляют.»

В 2014 году российские марионетки отступили из Славянска и Краматорска, чтобы консолидировать территорию дальше на восток и юг в ходе конфликта, в результате которого погибло более 14 000 человек и который продолжался.

Россия, которая долгое время рассматривала бывшую советскую Украину как буфер против НАТО, в том же году аннексировала украинский полуостров Крым и поддержала сепаратистский мятеж после того, как поддерживаемый Москвой президент бежал перед лицом прозападных массовых протестов.

Президент России Владимир Путин сделал захват Донбасса в интересах сепаратистов главной целью войны после неудачного штурма Киева, начавшегося 24 февраля. мирные жители, решившие остаться в городах, считаются сочувствующими России.

Министр по делам ветеранов Юлия Лапутина, которая возглавляла оперативную группу, отбившую Славянск в 2014 году, преуменьшила это подозрение и сказала, что его едва ли можно распознать восемь лет назад.

«Это другой город. Он более проевропейский», — сказала она.

Губернатор Донецка Кириленко заявил, что часть пророссийских настроений явно осталась.

«Дело не только в том, что они нелояльны, но и в том, что они пытаются помочь наносить ракетные удары. Любой, кто вынашивает такую ​​идею и предпринимает такие действия, будет наказан.» добавил он.

Служба безопасности Украины в понедельник задержала в Краматорске мужчину, подозреваемого в передаче российской артиллерии координат украинских военных позиций, сообщили в пресс-службе.

Усилены проверки автомобилей, въезжающих в города, а официальные лица и солдаты отказываются обсуждать планы по защите региона.

На почти заброшенном главном рынке Славянска 53-летний фермер Авраменко сказал, что не может обрабатывать большую часть своих шести акров на окраине, потому что они были заминированы, чтобы отразить наступление русских.

Он предсказал, что жители будут сражаться с силами вторжения на улицах, и сказал, что при необходимости присоединится к силам территориальной обороны, как и в 2014 году.

«Очевидно, что плохо, что тогда, в 2014 году, не было найдено решения. Мы должны прогнать их сейчас и покончить со всем этим», — сказал он, собирая чеснок, который не смог продать .

На этот раз артиллерийский обстрел был гораздо более интенсивным, и ему часто приходилось прятаться в подвале, сказал он.

Через несколько часов рынок загорелся после обстрела, в результате которого по меньшей мере два человека погибли и семеро получили ранения.

Под редакцией Тома Балмфорта и Джона Стоунстрит

Наши стандарты: Принципы доверия Thomson Reuters.

50 000 предполагаемых российских военных преступлений в Украине. NPR посмотрел на одну смерть: NPR

Александр Бреус, украинец и бывший французский легионер, был убит рядом со своей машиной во время российского вторжения. Александр Холод, который говорит, что видел это из своего окна, описывает события, когда он проезжает на велосипеде мимо обгоревших остатков автомобиля недалеко от Новой Басани, Черниговская область, Украина, 28 июня. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Александр Бреус, украинец и бывший французский легионер, был убит рядом со своей машиной во время российского вторжения. Александр Холод, который говорит, что видел это из своего окна, описывает события, когда он проезжает на велосипеде мимо обгоревших остатков автомобиля возле Новой Басани, Черниговская область, Украина, 28 июня.

Кэрол Гьюзи для NPR

Когда я впервые услышал о мертвом человеке на улице, я не знал его имени.

Это был просто рассказ, о возможном военном преступлении, совершенном в первые дни российского вторжения в Украину. Жертвой стал украинец, предположительно убитый российскими солдатами и оставленный мертвым на улице рядом со своей взорванной машиной, недалеко от места под названием Нова Басан.

Сначала история об этом человеке выделялась тем, что она была другой. Очевидно, он когда-то был членом французского Иностранного легиона. И, возможно, я думал, что это может означать улики и расследования — может быть, даже последствия — далеко за пределами крошечной деревни, где он умер, в 50 милях к северо-востоку от Киева.

Но когда я разговаривал со следователями и правозащитниками об этом и многих других делах, я, как и они, пришел к пониманию того, насколько неуловимым может быть правосудие по любому из 50 000 предполагаемых военных преступлений в Украине.

Георгий Гогия, следователь Хьюман Райтс Вотч, который первым рассказал мне об этом деле, сказал, что задокументировал так много преступлений, что у него нет времени расследовать это дело.

А Александра Матвийчук, возглавляющая Центр гражданских свобод, один из лауреатов Нобелевской премии мира в этом году, сказала, что начала воспринимать военные преступления как простую статистику.

«Я начала использовать числа вместо имен», — сказала она.

Я хотел сосредоточиться на имени, а не на номере, показать лицо всем очевидным преступлениям, а также оценить, возможна ли справедливость. Если бы я мог раскрыть хотя бы одно убийство — узнать о жертве, о том, что произошло, кто несет ответственность — может быть, это показало бы, насколько велика вероятность привлечения к ответственности всех их.

Чтобы понять эту историю, я снова решил сосредоточиться только на одной — на истории с мертвецом на улице возле Нова Басана.

Деревни Новый Басан и Бобровица

Бойцы Войск территориальной обороны Украины идут по Новому Басану после взятия села у российской армии 1 апреля. Агентство Нарцисо Контрерас / Анадолу через Getty Images скрыть заголовок

переключить заголовок

Агентство Нарцисо Контрерас / Анадолу через Getty Images

Бойцы Войск территориальной обороны Украины идут по Новому Басану после взятия села у российской армии 1 апреля.

Агентство Нарцисо Контрерас / Анадолу через Getty Images

Впервые я посетил Нова Басан в мае, примерно через месяц после того, как украинские войска освободили село от русских. Это была небольшая община, окруженная сельскохозяйственными угодьями, с населением менее 3000 человек.

Перед войной семьи уезжали из Киева, чтобы проводить там лето.

Теперь на дорогу выстроились обгоревшие корпуса русских танков.

Найти место убийства было нетрудно: все в деревне знали, где оно находится. Двое мужчин, стоявших возле брошенного танка, указали на то место, где машина мужчины все еще стояла вдоль шоссе, как памятник насилию, нанесенному российским вторжением в конце февраля.

Автомобиль «Ситроен» французского производства был болезненно-белого цвета, сильно обгоревший, с хаотично разбросанными обгоревшими деталями. Большая часть передней части машины исчезла, оторванная явным взрывом. Началась ржавчина.

И тела мужчины больше не было.

Мы направились в центр поселка, мимо разрушенного местного кафе и разграбленного супермаркета, к ратуше, к местному администратору Николаю Дьяченко. В своем кабинете, где окно все еще имело пулевое отверстие после боя, он рассказал мне все, что знал.

Это было немного. По словам Дьяченко, мужчина был убит, когда российские войска вошли в село 28 февраля. Он действительно когда-то был французским легионером, но отслужил свой контракт и вернулся домой в Украину до начала войны.

Дьяченко не знал имени погибшего, но знал его мать, Оксану Бреус. Она жила в другом селе, Бобровице, примерно в 30 минутах езды. Она пригласила нас к себе, чтобы обсудить ее сына.

Оксана Бреус держит фотографию сына Александра у себя дома в Бобровице. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Оксана Бреус держит фотографию сына Александра у себя дома в Бобровице.

Кэрол Гьюзи для NPR

Когда мы приехали, она приветствовала нас в своем доме и положила фотографию своего сына на стол между нами, пока мы сидели на кухне.

Ее сына зовут Александр, сказала она. Александр Бреус. Он был убит в первую неделю войны в возрасте 28 лет.0003

«Он ехал в Киев, чтобы забрать свою сестру и свою невесту. Он хотел забрать их во Францию», — сказала нам Оксана. Она не знала подробностей о том, как он умер, и сказала, что не хочет знать. Но у нее было видео с места происшествия, снятое в день смерти Александра, которое распространилось в соцсетях.

Она сыграла ее для нас, а потом заплакала.

На видео показана та же сгоревшая машина, которую мы видели ранее, с большой дырой в задней двери со стороны водителя. Камера поворачивается вправо, показывая тело мужчины, лежащего на земле у машины, его правая рука закинута на то, что осталось от его головы. Похоже на казнь.

«Русские проехали, черт возьми», — сказал человек, записывающий видео. «Бедняга.»

Оксана была слишком расстроена, чтобы продолжать разговор, и предложила поговорить с сестрой Александра для более подробной информации. Проводя нас во двор, она остановилась, чтобы показать нам еще одну вещь.

Немецкая овчарка с грустными глазами сидит в вольере — собака Александра Клиффорд.

«Какая красивая собака», сказала она. — Видишь, как сильно он по нему скучает?

Расследование военного преступления

Оксана показывает фотографию сына в форме французского Иностранного легиона. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Оксана показывает фотографию своего сына в форме французского Иностранного легиона.

Кэрол Гьюзи для NPR

Когда мы смотрели видео, которое нам показала Оксана — явный взрыв, насилие над Александром — казалось очевидным, что он был убит боевым оружием. Учитывая то, что мы знали еще, это делает убийство Александра почти наверняка военным преступлением, совершенным российскими войсками.

На видео Александр одет в гражданское: коричневую куртку. Нет никаких доказательств того, что он был вооружен, и его семья заявила, что у него не было оружия.

Его машина смотрела на запад, в сторону Киева. Это говорит о том, что, когда он был разрушен, он был обращен в сторону, противоположную направлению наступления российских войск.

И если он умер 28 февраля, как нам рассказали его мать, городской администратор и другие, маловероятно, что его убийство было результатом действий украинских сил. Каждый человек, с которым мы разговаривали в Новом Басане, говорил нам, что украинские военные, застигнутые врасплох первоначальным вторжением, не присутствовали ни в Новом Басане, ни вокруг него, когда был убит Александр.

Военные преступления регулируются рядом международных законов и договоров. Но есть и местные законы. В украинском уголовном кодексе есть специальный закон, который касается военных преступлений, расследование которых возложено на таких людей, как Вадим Примачок.

«Мы рассматриваем убийства. Мы рассматриваем пытки. Мы рассматриваем грабежи. Мы рассматриваем причинение вреда гражданским лицам», — сказал Примачок, высокопоставленный сотрудник Государственного бюро расследований Украины.

Мы показали Примачку видео с Александром и машиной.

«По моему мнению, это очень явное дело о военном преступлении… в том смысле, что они видели, кто он такой. У них был шанс не стрелять», — сказал нам Примачок. «Не было никакой угрозы, которую он представлял против кого-либо из русских, находившихся поблизости».

Примачок сказал нам, что не он занимается расследованием дела Александра Бреуса. Итак, мы поехали в город Чернигов, столицу области, где был убит Александр. Там Сергей Василина возглавляет областную прокуратуру.

Когда мы были у него недалеко от белорусской границы, он перечислил трудности, с которыми он столкнулся как следователь и прокурор во время войны.

Ему не хватало следователей и медицинских экспертов. Те, что у него были, не могли получить доступ к местам предполагаемых преступлений из-за продолжающихся боевых действий. И большинство людей в его кабинете всю свою карьеру были гражданскими лицами, не имевшими большого опыта в тонкостях расследования и судебного преследования за военные преступления.

А еще возникла проблема с огромным количеством дел.

«Мои прокуроры, мы тратим 24/7 на эти 1300 дел», — сказала нам Василина в июле.

Дело Александра было как раз тем, чем жонглировали перегруженные следователи. Василина сказала, что они делают все возможное, чтобы узнать больше, и свяжутся, если у них будет больше информации.

Кем был Александр Бреус?

Сестра Александра Аня Бреус утешает плачущую мать Оксану. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Сестра Александра Аня Бреус утешает плачущую мать Оксану.

Кэрол Гьюзи для NPR

Впервые я встретил сестру Александра, Аню Бреус, в конференц-зале гостиницы в центре Киева. Ей не терпелось рассказать нам о своих теплых воспоминаниях, классических историях о непослушных братьях и сестрах.

Например, когда она разбила потолочную лампу в их доме.

«Я ему сказала, не [говори] маме… Он сказал: „Я ей не скажу, если ты будешь две недели мыть посуду“», — смеясь, вспоминает Аня. — Да, это забавная история.

Александр Бреус тоже был яростным украинским патриотом, говорили другие. Хотя он мог говорить по-русски, он часто отказывался, чтобы доказать свою точку зрения.

«Для него было важно отделить нас от них», — сказал близкий друг Саша Грушко.

Александр заходил онлайн на веб-сайт Chatroulette, чтобы обсудить с русскими историю и указать, в чем, по его мнению, разница между украинцами и русскими.

«Он всегда смотрел видео об украинской истории. Он нам все время говорил, что русские — ужасные люди», — вспоминает Аня.

Те, кто знал его лучше всех, говорят, что Александр тоже был несколько беспокойным. Его увлечения были разнообразны: он был капитаном баскетбольной команды своего колледжа; он любил фотографию и искусство запечатлевать воспоминания; и он проводил долгие дни в дороге, катаясь на велосипеде.

Некоторое время он даже был рэпером-любителем.

У него была степень по сельскому хозяйству, но не было четкого плана на будущее. Было много грандиозных идей — с одним другом он обсуждал открытие комиссионного магазина; с другой, перспектива открытия бара.

В 2018 году он вступил во Французский Иностранный легион, чтобы найти дисциплину и стабильную работу.

Оксана держит фотографию Александра в форме французского Иностранного легиона. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Оксана держит фотографию Александра в форме французского Иностранного легиона.

Кэрол Гьюзи для NPR

«Он искал себя», сказал Хрушко. «Он искал какой-то реализации. Вот почему он только что нашел… себя во Французском легионе».

Карьера в армии Александра вполне устраивала — он хорошо себя чувствовал в стрессовых ситуациях.

Борис, коллега из французского Иностранного легиона, который просил не называть его фамилию, поскольку он все еще находится в легионе, назвал его спокойным и собранным. «Он мог очень легко справляться с трудными ситуациями», — сказал он. «Он был очень уравновешенным, хладнокровным».

Александр был в легионе четыре года. Но Борис сказал, что после того, как Александр усугубил старую травму во время полосы препятствий, он был вынужден работать на административной работе.

В конце 2021 года Александр покинул французскую армию, получив вид на жительство во Франции.

Борис также рассказал нам о девушке Александра, Юлии Погиба.

Александр и Юля пытались завести отношения на расстоянии, пока он был во Франции, но это было непросто. Живя в Украине, она восприняла его заявление на получение вида на жительство во Франции как признак того, что он не относится к ней серьезно.

Александр решил вернуться в Украину примерно за месяц до начала российского вторжения, пытаясь наладить отношения. Они начали мириться, а Александр всерьез заговорил с друзьями о женитьбе.

— Я уверен, что он хотел сделать предложение, — сказал Борис.

Застрял в Бобровице

Пожарные реагируют на пожар в здании после бомбардировки российскими войсками города Чугуев на востоке Украины 24 февраля. Арис Мессинис/AFP через Getty Images скрыть заголовок

переключить заголовок

Арис Мессинис/AFP через Getty Images

Пожарные реагируют на пожар в здании после бомбардировки российскими войсками города Чугуев на востоке Украины 24 февраля.

Арис Мессинис/AFP через Getty Images

24 февраля Россия вторглась в Украину.

Вместе со своей девушкой в ​​пригороде Киева Александр уехал в дом своего детства в Бобровицу вместе со своей собакой Клиффордом. Собака не ладила с собакой Юлии, поэтому он планировал высадить ее и вернуться в столицу — два часа езды — чтобы эвакуировать свою подругу и сестру в западную Украину и, в конечном итоге, из страны. .

Но украинское правительство внезапно ввело многодневный комендантский час в Киеве, по сути заперев его на месте и не дав ему вернуться. Неопределенная, тревожная ситуация довела его до слез.

«Он был разочарован, потому что хотел как можно скорее [дойти] до Юлии. И он пробыл в Бобровице два дня», — рассказала его сестра Аня. «Это был первый раз, когда я услышал, как он плачет по телефону».

Тем временем длинная вереница российской бронетехники и солдат катилась по тому же шоссе, по которому Александру в конечном итоге нужно было ехать в Киев.

Украинские силы, численно превосходящие и застигнутые врасплох, пытались сделать все возможное, чтобы замедлить продвижение русских. Один местный украинский чиновник сообщил, что в соседнем с Новым Басанем городе украинские военные взорвали мост, чтобы остановить наступление русских. Он также сообщил, что российские солдаты убили шестерых мирных жителей, проходя через город.

То же самое рассказывали и другие гражданские лица, описывая бессмысленные расстрелы безоружных местных жителей, случайно проходивших мимо.

Затем, утром 28 февраля, через четыре дня после вторжения, украинские власти отменили комендантский час в Киеве.

Спутниковый снимок северной оконечности российской колонны к юго-востоку от Иванкова, Украина, 28 февраля. Максар Технологии / Getty Images скрыть заголовок

переключить заголовок

Максар Технологии / Getty Images

Спутниковый снимок северной оконечности российской колонны к юго-востоку от Иванкова, Украина, 28 февраля.

Максар Технологии / Getty Images

Александр начал свой путь в столицу.

И русские войска тоже.

Российские войска вошли в Новый Басан

Юлия Гожак, жительница Нового Басана, рассказала нам, что утром она пошла за продуктами со своим взрослым сыном. Она слышала, что утром в пекарне был свежий хлеб.

Но пока она делала покупки, в магазин ворвался ее сын.

«Мама, забудь про хлеб!» он сказал. «Пошли! Я слышу, как рядом с кирпичным заводом стреляют танки!»

Эти двое запрыгнули в ее машину, а ее сын сидел за рулем. Выезжая из села, они оказались на перекрестке: дорога на Бобровицу, откуда ехал Александр.

Хаос разразился, когда она проезжала перекресток. Российская бронетехника стояла на дальней стороне и, увидев машину, открыла огонь.

«Танков я не видела. Я только слышала выстрелы и видела дым», — сказала она.

Переднее стекло разбилось, когда пули проникли внутрь ее машины. Гожак закрыла лицо руками, а пуля попала в телефон, который она несла, и срикошетила ей в руку.

Гожак удалось наверстать дорогу к дому.

Двигаясь в обратном направлении, Александр собирался проехать через тот же перекресток.

Убийство Александра Бреуса

Александр покинул дом своего детства около 8 утра, вскоре после отмены комендантского часа в Киеве. Его мать сказала, что провожала его — на нем были белые кроссовки «Найк» и свободные зеленые брюки. Пока он был за рулем, его отец, Николай, позвонил, чтобы проверить его.

«Я спросил: «Где ты?» [Александр] сказал: «Я нахожусь на блокпосту и вижу [российскую бронетанковую] колонну», — позже вспоминал Николай.

Он призвал Александра развернуться.

«Это единственное, о чем мы говорили, и это последний раз, когда мы разговаривали», — сказал отец Александра.

Где-то между 9 и 10 утра несколько человек в деревне говорят, что слышали взрыв.

Татьяна Барышовец работает в местном супермаркете, который рано закрылся, когда российские войска углубились в село. Местные жители прятались в своих домах, иногда в подвалах, когда войска вошли в Новый Басан, но Барышовец говорит, что решила рвануть домой на велосипеде.

Возвращаясь домой, она увидела горящую машину, рядом с которой лежало тело посреди дороги.

«Я остановилась. Я хотела проверить, жив ли он», сказала она. «Но было очевидно, что это не так. Головы я не видел, но руки и ноги были неестественно вывернуты».

Фотографии позже подтвердят, что зеленые штаны Александра были частично сожжены, обнажая почерневшую плоть ниже колена. Его белых кроссовок «Найк» не было — очевидно, огонь сжег их.

«Я весь дрожал, думал: «Зачем так убивать человека?», — вспоминал Барышовец. «Я начала плакать».

Она также осознала, что могла разделить судьбу Александра. Все дело было во времени: если бы Александр прибыл ненадолго раньше, он мог бы пройти до прихода русских войск. Если бы он пришел позже, то, возможно, вообще не смог бы пройти.

В тот же вечер Аня Бреус начала поиски своего брата. Весь день о нем никто не слышал. Она начала писать в социальных сетях.

Когда Грушко увидел пост, он ожидал худшего.

«В этот момент я действительно понимаю для себя, что он, вероятно, мертв, — сказал Грушко, — потому что [это займет всего] 2 часа [чтобы добраться] из Нова Басана в Киев».

Аня Бреус, сестра Александра, начала поиски своего брата, когда семья не получила от него никаких известий. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Аня Бреус, сестра Александра, начала поиски своего брата, когда семья не получила от него известий.

Кэрол Гьюзи для NPR

Незнакомец передал Ане Бреус видео с места преступления, которое гуляло по соцсетям. Она переслала его Грушко, который не сомневался, что на видео Александр.

«Достаточно просто увидеть его тело», — сказал Хрушко. — Я имею в виду, тут нечего обсуждать. Ты просто… просто почувствуй это.

Нам потребовались месяцы, чтобы собрать воедино то, что случилось с Александром, и мы знали гораздо больше, чем когда начинали. Мы знали, кто он такой, почему он был в дороге и примерно когда он умер. Мы нашли его дом, его семью — и даже слышали записи его голоса.

И все же мы почти ничего не знали о главном вопросе для прокуроров по военным преступлениям: как именно он был убит?

Для этого нам нужен был очевидец.

Появляется единственный очевидец

Местный администратор Новобасана Николай Дьяченко сомневается, что кто-то видел убийство.

«Насчет очевидцев не знаю. Наверное, их не было», — сказал он. «Когда русские вошли в нашу деревню, люди не выходили наружу».

Николай Дьяченко — местный администратор в Новом Басане. В его кабинете до сих пор есть пулевое отверстие от российского вторжения. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Николай Дьяченко — местный администратор в Новом Басане. В его кабинете до сих пор есть пулевое отверстие от российского вторжения.

Кэрол Гьюзи для NPR

Многие местные жители сказали, что они удалили сообщения, фотографии и сообщения в социальных сетях, когда русские ворвались в деревню, опасаясь, что их телефоны будут конфискованы оккупационными силами.

Владелец заправки через улицу, где погиб Александр, выключил камеры наблюдения перед вторжением российских войск в город, сообщили нам городские власти. Камеры в близлежащем супермаркете тоже не помогли, потому что российские войска забрали жесткие диски, когда заняли город.

Во многих случаях, как мы узнали, российские войска якобы уничтожали улики, которые показывали бы, кто там был. Мы обыскали дома в Новом Басане на предмет возможных свидетелей, но многие дома были пусты.

Это было похоже на тупик — пока однажды к нам не подошел мужчина и не сказал: «Я слышал, вы меня искали?»

Мужчину звали Александр Холод. Мы уже стучали в его дверь раньше, но его не было дома.

На этот раз он пригласил нас войти. Его квартира, стоявшая через дорогу от обломков машины Александра, была пыльной и темной внутри. Никакой электроники, никаких ковров. После начала войны Холод уехал.

Холод сказал, что был очевидцем убийства, и начал описывать то, что он видел утром 28 февраля, колонну российской бронетехники, приближающуюся к его селу.

— Я просто слышал шум, шум нарастал, идут… — начал он.

Александр Холод говорит, что видел смерть Александра Бреуса из своего окна в Новом Басане. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Александр Холод говорит, что видел смерть Александра Бреуса из своего окна в Новом Басане.

Кэрол Гьюзи для NPR

Но прежде чем он успел закончить рассказ, дверь распахнулась, и в дом ворвалась женщина. Ларису Анатольевну, лавочницу, с которой мы беседовали накануне, возмутило, что мы разговариваем с Холодом.

«Я пришла сюда, чтобы сказать людям правду, сказать правду, что вы сотрудничали с [русскими]», — сказала она. — Ты пил с ними, ты свободно передвигался на своем велосипеде. Скажи мне! Разве это не было? — крикнула она.

Холод защищался, говоря, что он был одним из немногих местных, кто действительно остался во время оккупации. Анатольевна не осталась, сказал он.

«Я здесь все видел своими глазами», — сказал Холод, добавив, что во время оккупации он готовил для русских солдат только потому, что они его заставили.

Я попросил Холода продолжить. Перебегая от окна к окну, он описывал то, что видел в день убийства Александра.

По его словам, солдаты оставили свои бронетранспортеры, известные как БТР, и рассредоточились по окрестностям по мере продвижения российских войск.

«В первой колонне, которую я увидел, [было] пять БТРов», — сказал он.

Увидел машину, ехавшую со стороны Бобровицы. Машина Александра. Тот самый сгоревший Citroen, что остался возле его дома.

Три БТРа шли впереди машины на дороге, Александр тянул рядом с четвертым.

Холод сказал, что видел, как Александр остановился и вышел из машины.

— Он начал с ними из-за чего-то ссориться, — сказал Холод. «Он начал говорить им что-то вроде: «Что вы здесь делаете?» и «Зачем ты это делаешь?»

Пока Александр говорил, двое солдат расположились позади него по дороге. По словам Холода, у одного был автомат. У другого — высокого — автомат.

Без предупреждения высокий открыл огонь примерно с 50 метров.

Холод сказал, что видел брызги крови из головы Александра, когда тот упал на дорогу. Затем ближайший БТР повернул башню на машину Александра и произвел выстрел из своего основного орудия.

Обугленные останки автомобиля Александра Бреуса припаркованы на обочине дороги в Нова Басане. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Обгоревшие останки автомобиля Александра Бреуса припаркованы на обочине в Нова Басане.

Кэрол Гьюзи для NPR

Описание Холодом того, что произошло утром 28 февраля, совпадает с другими собранными нами уликами. Дыра в боку автомобиля Александра могла быть местом, где по нему стреляла российская бронемашина. Направление брызг крови указывало на то, что стрельба началась приблизительно с направления, описанного Холодом.

И версия событий Холода совпала с деталями, показанными на видео с места происшествия, снятом в день убийства — видео, которое Холод говорит, что никогда не видел. Это последнее утверждение также казалось правдоподобным. У Холода не было смартфона.

Показания Холода стали центральным элементом нашего понимания смерти Александра, потому что они согласовывались со всеми остальными подробностями, которые мы узнали.

Подробности вроде того, что случилось с телом Александра.

Тело Александра лежит на улице

Через два дня после убийства Александра на место происшествия вернулась женщина на велосипеде Татьяна Барышовец. Она не могла вынести мысли о том, что тело Александра лежит на дороге.

Но кто-то — она не знала кто — добрался туда первым. По ее словам, на тело Александра была накинута легкая ткань и несколько кирпичей, чтобы удерживать его на месте. Ее преследуют воспоминания.

«Я не могу выкинуть это из головы, потому что… я вижу это каждый раз, когда иду на работу и с работы», — сказала она.

Российские войска за это время полностью заняли село Нова Басан. Жители говорят, что украинских сил поблизости не было. И описывают зверства русских солдат без сопротивления.

Нина Нахорна, учительница из Нова Басана, рассказала, что вскоре после того, как они вошли в деревню, во дворе у нее были десятки российских солдат, которые вели себя так, будто это место принадлежит им.

«Один из них… сказал нам, что уже убил шестерых мирных жителей», — сказала она. «А потом мы поняли, что им все равно, гражданские мы или нет. Мы поняли, что эти люди потеряли связь с реальностью».

Нина Нахорна рассказывает о захвате ее дома русскими солдатами и о том, как ее семья в ужасе пряталась в подвале в Нова Басане. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Нина Нахорна рассказывает о захвате ее дома русскими солдатами и о том, как ее семья в ужасе пряталась в подвале в Новом Басане.

Кэрол Гьюзи для NPR

Жители деревни сообщают, что в Новом Басане, кроме Александра, убиты мирные жители.

Николай Дьяченко, местный администратор, задержан и подвергнут инсценировке казни.

Это был тяжелый и жестокий период для жителей деревни.

«Они не люди, понимаете? Это монстры», — сказала 86-летняя Александра Лыска, у которой были убиты куры, отняты продукты и разрушен дом. «Они ужасные люди. Ужасные».

Тело Александра в течение месяца оставалось на улице в период российской оккупации. Члены семьи говорят, что возвращать его было слишком опасно.

«Нам сказали, что русские солдаты не разрешают никого хоронить», — сказала Аня, сестра Александра. «Моя мать рассказала мне, что также был убит один 14-летний мальчик. Его мать подошла к ним, стоя на коленях, и просила у них разрешения. Но они стреляли поверх ее головы и отправляли обратно».

Тем не менее, мать Александра каждый день связывалась с городским советом Нова Басан, чтобы узнать, разрешено ли им забрать тело. Но русские ввели строгие ограничения на передвижение и были склонны открывать огонь, чтобы убрать с дороги автомобили и мирных жителей.

Затем, в начале апреля, после ожесточенного боя украинские войска вернулись в Нова Басан. Наконец-то удалось забрать тело Александра.

Сергей Цыба сказал, что извлечение тел было его вкладом в войну.

— Я не боюсь, — сказал Цыба. «Мой отец всегда учил меня, что не нужно бояться мертвых. Бойся живых… Я не могу помочь солдатам. Я буду помогать людям, чтобы… Последняя поездка.»

4 апреля заданием Цыбы было отправиться в недавно освобожденное село Нова Басан.

Его руки начали дрожать, когда он прокручивал воспоминание. На этот раз он знал, кого он и его коллега собирали. Это был его друг Александр, которого он назвал по прозвищу Саша. Они вместе выросли в соседней Бобровице.

«[Мой коллега] сказал мне, кого мы забираем, когда ехали вниз. Я сказал ему, что действительно знаю Сашу, и поэтому так тяжело это воспринял», — вспоминает он.

Цыба отвечал за фотографирование места происшествия. Дикие звери растерзали тело Александра. Затем Цыба помог положить тело в гроб.

На фото мать Александра, Оксана, прибывшая на место, сломленная горем.

Оксана Бреус плачет, когда она приезжает, чтобы забрать тело своего сына во время нападения России на Украину в Нова-Басане в апреле. Сергей Нужненко/Reuters скрыть заголовок

переключить заголовок

Сергей Нужненко/Reuters

Оксана Бреус плачет, прибыв, чтобы забрать тело своего сына во время нападения России на Украину, в Новом Басане в апреле.

Сергей Нужненко/Reuters

Александра Бреуса привезли на маленькое кладбище, по дороге от дома его детства, и похоронили 6 апреля 2022 года. Вид тела его мертвого друга, пролежавшего месяц на морозе, возбудил в Цыбе что-то такое, что продержался бы гораздо дольше.

— Злость, — сказал Цыба. «Я никогда не чувствовал ничего подобного. Страх превратился в гнев и ненависть. Потому что мы никогда ни на кого не нападали, мы просто жили своей жизнью».

Преступники

При поиске свидетелей событий в Новом Басане мы нашли еще одно видео, на котором запечатлено движение российских войск через село в день убийства Александра. Мы связались с человеком, опубликовавшим это видео в Facebook, и тот сказал нам, что это видео сняла ее мать.

И вот мы зашли в мебельный магазин в Киеве, где работает менеджером Елена Бондаренко.

После начала войны Бондаренко бежала из столицы в дом, принадлежавший ее семье в Нова Басане, надеясь, что в маленькой деревне будет меньше боевых действий. В утро смерти Александра она стояла снаружи в состоянии шока, когда мимо проезжала бронетехника.

Она показала нам еще одно снятое ею видео о проходящих российских войсках. В кадре появляется вооруженный солдат и целится в нее из винтовки, заставляя ее задыхаться, прежде чем выстрелить в ее сторону. Бондаренко падает на пол, и отец тянет ее прочь.

Но позже она заметила что-то необычное в машинах на видео.

«Это были новые танки с буквой «О», — пояснила она. «По телевизору говорили только о «Z» и «V». Я рассказал украинским военным об этих машинах на букву «О». Они были совершенно другими. Это был другой тип бронированной машины, и они носили униформу другого цвета».

Тогда мы этого не знали, но видео Елены Бондаренко имели решающее значение для понимания того, какие российские подразделения находятся на земле.

Первой подсказкой была маркировка «О».

Российский танк с буквой «О» проезжает мимо дома Елены Бондаренко в Новом Басане. Елена Бондаренко/Скриншот NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Елена Бондаренко/Скриншот NPR

Российский танк с буквой «О» проезжает мимо дома Елены Бондаренко в Новом Басане.

Елена Бондаренко/Скриншот NPR

Мы установили источники в украинских спецслужбах, полиции и их прокуратуре — и показали им то, что нашли.

Они не могли сказать нам точно, какие части были в Нова Басане в тот день. Но нам сказали, что буква «О» означает, что это машины частей Центрального военного округа России.

Они также предоставили нам список российских подразделений, которые могли находиться в Новом Басане, когда был убит Александр.

Мы обратились к людям, которые отслеживают военную технику, изучая всю общедоступную информацию: Том Баллок, ныне бывший аналитик компании Janes, которая следит за военными по всему миру; и Джордж Баррос, аналитик Института изучения войны.

Свидетели сообщили, что российские войска в Новом Басане не носили знаков различия или нашивок, которые указывали бы, кто они и откуда.

Но и Буллок, и Баррос заявили, что на видео Бондаренко показан особый тип бронетранспортера, который называется БТР-82А.

Эта модель бронетранспортера была важной подсказкой. Из списка единиц, предоставленных нашими источниками, только небольшое количество имело это оборудование.

«Тот факт, что мы можем определить, что это БТР-82 тип А, имеет большое значение, потому что есть только две бригады [в Центральном военном округе России], которые фактически используют эту технику», — сказал Баррос. «А это 15-я бригада и 30-я бригада».

Российская военная доктрина предполагает, что эти БТРы и эти бригады — 15-я и 30-я — должны были использоваться для зачистки.

Поврежденный российский БТР-82 в селе Нова Басан, Украина, 1 апреля. Сергей Нужненко/Reuters скрыть заголовок

переключить заголовок

Сергей Нужненко/Reuters

Поврежденный российский БТР-82 в селе Нова Басан, Украина, 1 апреля.

Сергей Нужненко/Reuters

Расчистка — это задача, которую выполняют военные, когда они входят в спорный район, чтобы убедиться, что он безопасен», — объяснил Баррос. И он видит доказательства этой миссии в видео Бондаренко.

«Они идут по главной улице деревни, как она выглядит, и они проверяют, знаете ли, дом за домом. Они выглядывают из-за заборов. И то, что они, вероятно, делают, — это операция по очистке», — сказал он.0003

Определив две единицы, которые, скорее всего, находились в Нова Басане, мы значительно сократили количество подозреваемых. Российские военные перебросили на Украину сухопутные войска численностью около 120 000 человек во время своего первоначального вторжения.

В двух идентифицированных нами частях, 15-й и 30-й бригадах, было гораздо меньше солдат: около 4000 человек, сказал Баррос.

Наш очевидец Холод сказал, что видел пять БТРов в непосредственной близости от убитого Александра. Каждая машина рассчитана на 10 солдат.

Итак, если наши сообщения подтверждаются, убийца был среди группы примерно из 50 человек из 15-й или 30-й бригады, которые проходили через перекресток в Новом Басане между 9 и 10 часами утра 28 февраля. штурмовая винтовка.

Но мы достигли своего предела. Мы не смогли получить настоящие имена этих 50 человек, тем более того высокого с винтовкой.

Мы, , могли бы назвать одного потенциального обвиняемого по делу о военных преступлениях: российского офицера, ответственного за находившиеся там подразделения.

Минометный снаряд рядом с разрушенной военной машиной в Нова Басане, 1 апреля. Сергей Нужненко/Reuters скрыть заголовок

переключить заголовок

Сергей Нужненко/Reuters

Минометный снаряд рядом с уничтоженной военной машиной в Новом Басане 1 апреля.

Сергей Нужненко/Reuters

«Совершенно ясно, что в тот момент в Нова Басане мы видели значительные подразделения в этом районе, вероятно, под командованием российского генерал-полковника Александра Лапина», — сказал Баррос, опираясь на информацию из открытых источников.

Александр Лапин командовал людьми, которые якобы убили Александра и взорвали его машину.

Знание его имени может иметь большое значение: если собрать данные обо всех убийствах и перестрелках вокруг Нова Басана и если следователи смогут утверждать, что злодеяния носили систематический и массовый характер, они могут возложить ответственность за эти преступления на командира. Они может привлечь его к ответственности за военные преступления.

Есть и другие улики, которые еще предстоит раскрыть. Например: несколько месяцев назад мы встретились со следователями, ведущими дело Александра, которые сказали, что просматривают записи его мобильных телефонов и телефонов российских солдат, которые находились в этом районе.

А могли быть и другие записи о том, кто был на перекрестке. Роман Авраменко возглавляет украинскую неправительственную организацию Truth Hounds, которая документирует и расследует военные преступления.

«Может быть, через год или через 10 лет Россия рухнет, и украинские следователи получат полный список солдат, направляемых в разные районы», — сказал Авраменко.

Что касается статуса Александра как постоянного жителя Франции, мы спросили одного из ведущих юристов по правам человека, будет ли французское правительство расследовать это дело. Она сказала нам, что Александр не подходит для расследования военных преступлений во Франции, потому что он не гражданин. Французский Иностранный легион проигнорировал мою просьбу о встрече и обсуждении дела, за исключением того, что сказал, что он покинул легион в 2021 году9.0003

Мы рассмотрели возможность рассмотрения дела Международным уголовным судом. Международное право однозначно запрещает убийство безоружных гражданских лиц. Но мы быстро обнаружили, что МУС обычно не занимается такими делами, как дело Александра.

«Обычно они сосредотачиваются на высокопоставленных командирах и функционерах, отдающих приказы, и они сосредотачиваются на делах с [выдающимися или большим числом] жертв… или с массовым уничтожением. Так что, скорее всего, МУС не воспримет это случае», — пояснил Авраменко.

Украинским следователям предстоит показать, что отдельные военные преступления являются частью более крупной схемы.

На мемориальной доске на могиле Александра изображена его фотография. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

На могиле Александра табличка с его фотографией.

Кэрол Гьюзи для NPR

Это цель украинцев, таких как Вадим Примачок, высокопоставленный сотрудник украинского Государственного бюро расследований, который назвал министра обороны России, президента и генералов чиновниками, которых он хотел бы в конечном итоге привлечь к ответственности, показав «системные военные преступления». ,» он сказал.

Но украинская система заболочена.

Мы потратили месяцы на проведение около 100 интервью и поиск источников в Новом Басане и правительстве Украины. И, по крайней мере, на данный момент, мы не могли сузить его еще больше.

Смерть Александра была всего лишь одним предполагаемым военным преступлением. По всей Украине под следствием находится около 50 000 человек.

Даже те, кто годами занимается расследованием военных преступлений, пессимистично настроены в отношении достижения какой-либо полной меры справедливости.

«Честно говоря, я считаю невозможным установить справедливость по всем делам о военных преступлениях, совершенных в ходе полномасштабного вторжения», — сказал Авраменко.

Через четыре месяца после того, как Александра убили, мы с его сестрой и матерью поехали навестить его могилу. Вокруг грязной насыпи, где покоилось его тело, росли фиалки.

Оксана и Аня Бреус посещают могилу Александра через четыре месяца после его убийства. Кэрол Гьюзи для NPR скрыть заголовок

переключить заголовок

Кэрол Гьюзи для NPR

Оксана и Аня Бреус посещают могилу Александра через четыре месяца после его гибели.

Кэрол Гьюзи для NPR

В тот день мама Александра рассказала нам еще кое-что о своем сыне: в прошлом году, летя домой в Украину, он сделал пересадку в Нидерландах.

«Он знает, что я люблю цветы. У него было свободное время, и он купил мне семена тюльпанов», — объяснила она. «Сажал прошлой осенью, а в этом году 10 из 10 — все зацвели».

Они расцвели именно в День матери, сказала она, примерно через два месяца после смерти Александра.

Звук к этому рассказу подготовила Моника Евстатьева; под редакцией Барри Хардимона и Роберта Литтла; цифровое производство Мэг Андерсон; исследование Барбары Ван Вурком; обработка фотографий Эмили Богл; визуальные эффекты и графическое редактирование Ника Макмиллана и Ника Андервуда. Лука Олексишин, Росс Пелех, Евгений Афанасьев, Марк Рачкевич и Юлиан Хайда предоставили отчеты, переводы и помощь в исследованиях.

Использование метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 для улучшения диагностики резистентности к антигельминтам и эпиднадзора за желудочно-кишечными нематодами овец

• Список журналов
• Int J Препараты от паразитов
• т. 14; 2020 дек.
• PMC7548992

Int J Лекарственные препараты от паразитов. 2020 декабрь; 14: 105–117.

Published online 2020 Sep 19. doi: 10.1016/j.ijpddr.2020.09.003

, ^a , ^b , ^a , ^a , ^a , ^a , ^a , ^c и ^{a, ∗}

Информация об авторе Примечания к статье Информация об авторских правах и лицензии Отказ от ответственности

Дополнительные материалы

Отсутствие количественной информации о видовом составе сообществ паразитов, присутствующих в образцах фекалий, является основным фактором, ограничивающим чувствительность, точность и интерпретацию диагностических тестов, обычно используемых для оценки антигельминтной эффективности и резистентности. В этой статье мы исследуем способность метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 улучшать тестирование на снижение количества фекальных яиц, предоставляя информацию о влиянии лекарственного лечения на отдельные виды паразитов. Применение метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 к образцам фекалий овец более 90 стад на западе Канады выявили высокую интенсивность желудочно-кишечной нематодной инфекции во многих стадах, причем наиболее многочисленным видом был Haemonchus contortus , за которым следовал Teladorsagiacircincta , а затем Trichostrongylus colubriformis . Интеграция метабаркодирования рДНК немабиома ITS-2 с подсчетом фекальных яиц до и после лечения выявила неизменно низкую эффективность применяемых производителем обработок ивермектином и бензимидазолом против H. contortus, , но гораздо более эффективен против T.circincta и T.colubriformis , за исключением небольшого количества стад. Интеграция метабаркодирования рДНК ITS-2 немабиома с тестами на снижение количества яиц в фекалиях (FECRT), проведенная при посещении ферм, подтвердила, что устойчивость к ивермектину и фенбендазолу широко распространена у H. contortus , но в настоящее время менее распространена у T.circincta и . T. colubriformis в западной Канаде . Тестирование FECRT/nemabiome не выявило резистентность к моксидектину ни у одного из видов GIN, но предположило раннее появление резистентности к левамизолу, в частности, у Т. circincta. Также было выявлено, что хотя низкая эффективность клозантела была относительно распространена, основываясь на общем количестве фекальных яиц, это было связано с его узким спектром активности, а не с появлением устойчивости к глистогонным средствам. Это исследование иллюстрирует ценность метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 для улучшения тестирования устойчивости к подсчету фекальных яиц, проведения крупномасштабного эпиднадзора за устойчивостью к антигельминтам и более целенаправленного рационального использования противогельминтных средств.

Ключевые слова: Секвенирование ампликонов, Молекулярная диагностика, устойчивость к гельминтозам, FECRT, Haemonchus, Бензимидазолы

Открыто в отдельном окне

Прошло 50 лет с момента первых сообщений об устойчивости к гельминтам у овец (Drudge et al. , 1964; Smeal et al., 1968), и в настоящее время проблема разрослась и распространилась на все континенты, встречаясь с несколькими видами нематод и против нескольких классов лекарств (Chandrawathani et al., 2003; Čerňanská et al., 2006; Domke et al., 2012; Papadopoulos et al. ., 2012; Falzon et al., 2013; Chandra et al., 2014; Geurden et al., 2014; Lyndal-Murphy et al., 2014; Rose et al., 2015; Learmount et al., 2016a; Gárcia et al. al., 2016; Salgado and Santos, 2016; Ploeger and Everts, 2018). Однако методы, используемые для диагностики антигельминтной резистентности, очень мало изменились и в основном основаны на определении снижения количества фекальных яиц после антигельминтной обработки. Одним из основных ограничений этих подходов является то, что коинфекция обычно происходит с несколькими видами нематод, которые имеют яйца стронгильного типа, которые могут быть выделены на уровне рода только с помощью микроскопии и с помощью специалиста. Следовательно, простое процентное снижение количества яиц стронгилов имеет ограниченную чувствительность и точность для определения устойчивости к антигельминтам, когда популяция паразита состоит из смеси устойчивых и восприимчивых видов. Методы, доступные для идентификации видов нематод, включают сопрокультуру в сочетании с морфологией и морфометрией L3, обычную ПЦР, ПЦР в реальном времени, капельную цифровую ПЦР (Elmahalawy et al., 2018) и пиросеквенирование (Álvarez-Sánchez et al., 2005; Roeber et al. ., 2011, 2017; Milhes et al., 2017). Каждый из этих подходов имеет различные ограничения. Сопрокультура личинок и морфологическая идентификация личинок L3 занимают 7–14 дней, требуют специальных знаний и могут быть неточными из-за предвзятости культур, специфичных для вида. Его часто не проводят для рутинной клинической диагностики, и он требует очень много времени при применении в крупномасштабных исследованиях и наблюдениях (Coles et al., 19).92, 2006 г.; Лихтенфельс и Пилитт, 2000 г.; Макмертри и др., 2000; Ван Вик и др., 2004 г.; Амаранте, 2011 г.; Баррер и др., 2013 г.; Юнгстрем и др., 2018). Подходы, основанные на ПЦР в реальном времени и ddPCR, более точны, но требуют тщательной оптимизации и проверки между лабораториями для точного количественного определения. Кроме того, анализы должны быть индивидуально подтверждены для каждого вида, и будут идентифицированы только те виды, присутствие которых предполагается (Roeber et al., 2011, 2017).

Метабаркодирование немабиома — это недавно разработанный подход «в стиле микробиома», который включает короткое считывание следующего поколения ампликонов рДНК внутреннего транскрибируемого спейсера (ITS-2) для идентификации видов нематод и относительного количественного определения (Avramenko et al., 2015). Первоначально он был разработан для относительного количественного определения видов желудочно-кишечных нематод крупного рогатого скота (GIN) из копродукции личинок L3, но совсем недавно был одобрен для использования на яйцах и личинках L1, выделенных из образцов фекалий овец (Redman et al., 2019).). Он также применялся к бизонам (Avramenko et al., 2018), лошадям (Mitchell et al., 2019) и образцам фекалий диких животных (Barone et al., 2020). Он имеет ряд преимуществ, включая чувствительность, специфичность, универсальность, масштабируемость и высокую рентабельность для больших выборок (Авраменко и др. , 2015; Редман и др., 2019). Метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 позволяет объединять и секвенировать сотни образцов за один цикл секвенирования, чаще всего Illumina MiSeq (Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США), что снижает стоимость отдельного образца. Другим преимуществом является высокая точность, генерирующая от тысяч до миллионов считываний от сотен или тысяч яиц или личинок на образец, которые сравниваются с эталонной базой данных для идентификации видов без необходимости использования видоспецифических праймеров. Он также может идентифицировать одну личинку в пуле тысяч, что является преимуществом для наблюдения и идентификации редких видов, которые, вероятно, были бы упущены с помощью обычных методов, таких как морфология.

В этой статье мы исследуем интеграцию метабаркодирования рДНК ITS-2 с тестированием на снижение количества фекальных яиц, чтобы предоставить конкретную информацию о надзоре за паразитами, антигельминтной эффективности и антигельминтной устойчивости для отдельных видов GIN. Мы демонстрируем ценность этого подхода, используя крупномасштабное исследование антигельминтной эффективности и резистентности стад овец в западной Канаде, регионе, где ранее практически не сообщалось о такой информации.

2.1. Исследование эффективности антигельминтных препаратов, применяемых производителями

2.1.1. Коллекция образцов

Для оценки эффективности антигельминтных обработок, проводимых производителями в западной Канаде, в период с июня по сентябрь с 2014 по 2018 год проводились ежегодные опросы, в которых участвовали 7 производителей из Британской Колумбии (Британская Колумбия), 55 из Альберты (AB), 18 из Саскачевана (Словакия) и 12 человек из Манитобы (МБ). Набор производителей осуществлялся в основном из респондентов на рекламные объявления, размещенные в информационных бюллетенях производителей, с просьбой к участникам со стадами не менее 20 овец.

Производителям было предложено подождать не менее восьми недель после последней обработки антигельминтными препаратами, чтобы принять участие. Обработку и отбор проб проводили производители, снабженные комплектом для отбора проб, вопросником, перчатками, полиэтиленовыми пакетами для сбора индивидуальных проб фекалий и инструкцией. Производителей попросили собрать образцы фекалий у 20 овец, либо 90 513 из прямой кишки 90 514, либо только что выделенные на пастбище, с последующим лечением их текущим препаратом выбора и сбором второго набора образцов фекалий от тех же овец через две недели.

Образцы были запечатаны в пластиковые пакеты, плотно зажаты для удаления воздуха и предотвращения вылупления яиц и отправлены в лабораторию в течение 24 часов с момента сбора курьером с предоплатой. Производителей просили не охлаждать и не замораживать образцы перед отправкой. В лаборатории образцы фекалий хранились при комнатной температуре и обрабатывались в течение 24 часов после прибытия. Для ферм, которые участвовали более одного раза в период с 2014 по 2018 год, сюда включены только результаты за последний год участия. Производители, которые не отправили образец после обработки, не соблюдали двухнедельный интервал или чьи образцы были повреждены или не запечатаны, не включались в исследование эффективности лечения.

2.1.2. Расчет снижения количества яиц в фекалиях (FECR)

В лаборатории отдельные образцы тщательно перемешивали и объединяли по одинаковому весу, добавляя максимально возможное количество на основе наименьшего образца, но не менее 6 г. Чтобы определить количество яиц стронгильного типа на грамм (EPG) фекалий до и после лечения лекарственным средством, мы рассчитали среднее значение четырех независимых подсчетов яиц в кале, выполненных на 2 г каждого объединенного образца, с использованием модифицированного метода Макмастера с чувствительностью 16,66 EP G (Paracount-EPG™, Chalex, LCC). Эффективность антигельминтной обработки оценивали путем сравнения среднего значения ЭПГ пула из 20 овец до и после лечения по следующей формуле: Эффективность = 100%*(1 — среднее значение после ЭПГ до ЭПГ). Эффективность лечения ниже 95% считалось субоптимальным.

2.2. Тест на снижение количества яиц в кале (FECRT)

2.2.1. Сбор образцов

Одиннадцать ферм в Альберте и три фермы в Саскачеване были посещены дважды с интервалом в две недели, с июня по сентябрь с 2014 по 2018 год, для сбора образцов для проведения тестов на снижение количества фекальных яиц. Критерии для включения ферм в эту часть исследования заключались в том, чтобы они были расположены в пределах 3 часов езды от Университета Калгари или Университета Саскачевана, имели не менее 80 овец, имели в анамнезе высокую интенсивность инфекции GIN (на основе при среднем количестве яиц в фекалиях выше 400 яиц на грамм в образцах от 20 случайно выбранных овец, отправленных за две-три недели до первого визита) и, в некоторых случаях, озабоченность производителя проблемами борьбы с паразитами. При первом посещении взрослых овец случайным образом распределяли в лечебные группы по 20–25 животных в каждой. Овец идентифицировали по их радиочастотной идентификации (RFID) или номеру ушной бирки и взвешивали. Образцы фекалий были собраны per rectum и антигельминтные средства вводили перорально в соответствии с рекомендациями производителя. Образцы фекалий были собраны в соответствии с утвержденным протоколом использования животных (Комитет по уходу за животными, исследование № AC13-0157, Университет Калгари), что соответствует принципам, изложенным в действующих Руководящих принципах Канадского совета по уходу за животными. Протестированные антигельминтные средства включали ивермектин, фенбендазол, клозантел, левамизол и моксидектин (см. Дополнительную таблицу 1 для получения подробной информации о классах препаратов, торговых марках, дозировке и активности антигельминтных средств, использованных в этом исследовании). При втором посещении у тех же овец были собраны образцы фекалий.

2.2.2. Расчет FECR

Яйца типа Strongyle в каждом отдельном образце подсчитывали с использованием модифицированного метода McMaster, описанного выше. Снижение количества яиц оценивали путем сравнения числа яиц в фекалиях одной и той же группы животных до и после лечения, FECR рассчитывали с использованием того же уравнения, описанного в 2.1.2, и доверительного интервала, как описано Levecke et al. (2018), уравнение 1. Все овцы с положительным числом фекальных яиц до лечения были включены в расчет. Мы стремились подсчитать в образцах до обработки под микроскопом не менее 400 яиц на группу лечения, добавив дополнительную камеру для предметных стекол и при необходимости изменив коэффициент размножения, чтобы увеличить мощность исследования (Levecke et al. , 2018). . Объединенный образец с 2 г каждого отдельного образца был подготовлен для последующей идентификации видов нематод.

2.3. Выделение личинок первой стадии

Личинки первой стадии были получены из образцов до и после обработки для приготовления лизата ДНК с использованием протокола, адаптированного из Mes et al. (2007). Аликвоту 24 г каждого из объединенных образцов тщательно смешивали со 100 мл 13% раствора хлорида натрия (удельный вес 1,06) и промывали через крупное кухонное сито, позволяя яйцам пройти, сохраняя при этом крупные твердые частицы. Фильтрат, содержащий яйца, поровну распределяли по четырем пробиркам Falcon объемом 50 мл и центрифугировали при 3600 G в течение 5 мин при комнатной температуре, чтобы яйца всплыли. Супернатант переносили в новые пробирки Falcon объемом 50 мл и добавляли равный объем дистиллированной воды после центрифугирования в тех же условиях. С помощью аспирации вакуумным насосом супернатант осторожно удаляли и добавляли 5 мл 13% раствора хлорида натрия для ресуспендирования яиц в осадке перед повторным 5-минутным центрифугированием при 3600 G. Затем надосадочную жидкость из четырех пробирок объединяли в новую 50 мл пробирки Falcon, добавили равное количество дистиллированной воды и снова центрифугировали пробирку при 3600 G в течение 5 мин, а надосадочную жидкость удаляли вакуумной аспирацией. Осадок ресуспендировали в 25 мл дистиллированной воды и промывали через предварительно смоченную 20  9Сито 0513 мкм мкм для задержания яиц и удаления остатков солевого раствора. Яйца, оставшиеся на сите, промывали в чашке Петри и инкубировали с водопроводной водой при 22 °C в течение 24–48 ч для вылупления яиц. После инкубации суспензию L1 охлаждали при 4°С в течение 3 ч, а затем центрифугировали при 4500 G при 4°С в течение 10 мин. Супернатант удаляли с помощью вакуумной аспирации, а собранные L1 фиксировали в 70% этаноле и хранили при 4 °C до использования. Скорость вылупления яиц определяли путем подсчета невылупившихся яиц и L1 в трех аликвотах по 500 мкл суспензии (в среднем 88%, диапазон 48–100%, медиана 9).1%, дополнительная таблица 2).

2.4. Экстракция геномной ДНК и секвенирование ампликона немабиома рДНК ITS-2

2.4.1. Препараты лизатов для выделения ДНК

Приблизительно 500 личинок, собранных из каждого объединенного образца фекалий, использовались для приготовления лизатов ДНК в начале исследования (2014–2016 гг.). Однако после демонстрации надежности метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 для меньшего количества личинок (Redman et al., 2019) были приготовлены последующие лизаты ДНК с 200 личинками по методу, описанному Avramenko et al. (2015). В дополнительной таблице 3 указано количество личинок, включенных в каждый лизат. В тех образцах, где общее количество личинок составляет менее 200, например, в образцах после обработки с низкими значениями FEC из-за высокой эффективности препарата, лизаты ДНК готовили из всех личинок, собранных из образца. Фиксированные этанолом личинки L1 трижды промывали центрифугированием при 13000 G с лизисным буфером собственного производства (50 мМ KCl, 10 мМ Трис, pH 8,3, 2,5 мМ MgCl 9 ). 1701 2 , 0,45% Nonidet p-40, 0,45% Tween-20, 0,01% желатина) для удаления избытка этанола. Осадок ресуспендировали в 50 мкл буфера для лизиса, помещали в -80 °C на 1 час, а затем лизировали путем добавления 6 мкл 20 мг/мл протеиназы K (Thermo Scientific) и нагревания при 55 °C в течение 120 минут; с последующим выдерживанием при 95 °C в течение 20 минут для инактивации протеиназы K. Полученный лизат разбавляли 1:10 водой молекулярной чистоты для использования в качестве матрицы ПЦР, а оставшийся исходный лизат хранили при -80 °C.

2.4.2. ПЦР-амплификация и немабиомное метабаркодирование локуса 9 рДНК ITS-21665

Было проведено глубокое секвенирование ампликонов ампликонов рДНК ITS-2, полученных из популяций личинок L1, собранных из объединенных образцов фекалий. Локус рДНК ITS-2 размером 311–331 п.н. был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием модифицированных праймеров NC1 и NC2, комплементарных кодирующим областям 5,8 S и 28 S, как описано ранее (Gasser et al., 2008; Avramenko et al. , 2015; Redman et al. др., 2019). Всего было использовано четыре прямых (NC1_Adp, NC1_Adp1N, NC1_Adp2N, NC1_Adp3N) и четыре обратных (NC2_Adp, NC2_Adp1N, NC2_Adp2N, NC2_Adp3N) праймеров, где Adp — тег секвенирования адаптера Illumina, добавленный для обеспечения возможности дальнейшего отжига праймеров для секвенирования, и N — количество случайных нуклеотидов, добавленных между последовательностью праймера и адаптером для введения разнообразия ампликонов для предотвращения насыщения флуоресцентного сигнала при секвенировании Illumina (Авраменко и др., 2015). Условия реакции ПЦР: 5 мкл 5X KAPA HiFi Buffer, 0,75 мкл смеси праймеров NC1 (10 мМ), 0,75 мкл смеси праймеров NC2 (10 мМ), 0,75 мкл dNTP (10 мМ), 0,5 мкл полимеразы KAPA HiFi HotStart (0,5 ед. KAPA Biosystems, США), 13,25 мкл ddH ₂ O и 4 мкл лизата, разведенного в соотношении 1:10. Параметры термоциклирования: 95°C в течение 2 минут, затем 25 циклов 98°C в течение 20 с, 62°C в течение 15 с, 72°C в течение 15 с и окончательное удлинение до 72°C в течение 2 мин.

Продукты ПЦР очищали с помощью магнитных шариков AMPure XP (Beckman Coulter, Inc) перед добавлением индексов штрих-кодирования Illumina и меток P5/P7 с помощью ПЦР-амплификации с ограниченным циклом. На этом этапе было использовано 8 прямых и 12 обратных праймеров штрих-кода для создания 96 уникальных комбинаций штрих-кода. Последовательности праймеров были получены из Письма о секвенировании клиентов Illumina (7 сентября 2012 г., последовательности олигонуклеотидов, 2007–2012 гг., Illumina, Inc. Все права защищены), как описано Avramenko et al. (2015). Условия реакции ПЦР: 5 мкл 5X KAPA HiFi HotStart Fidelity Buffer (KAPA Biosystems, США), 1,25 мкл прямого праймера (S502–S522) (10 мкМ), 1,25 мкл обратного праймера (N701–N729).) (10 мкМ), 0,75 мкл dNTP (10 мМ), 0,5 мкл полимеразы KAPA HiFi HotStart (0,5 ед.), 13,25 мкл молекулярной чистоты dH ₂ O и 3 мкл очищенного продукта ПЦР первого раунда в качестве матрицы. Параметры термоциклирования: 98°С в течение 45 с, затем девять циклов: 98°С в течение 20 с, 63°С в течение 20 с, 72°С в течение 2 мин. Ампликоны очищали с помощью магнита AMPure XP (Beckman Coulter, Inc). Концентрацию каждого очищенного ампликона определяли с использованием спектрофотометра NanoVue plus (GE) и аликвот по 50 нг, объединенных для создания библиотеки. Конечную концентрацию объединенной библиотеки оценивали с помощью набора KAPA qPCR Library Quantification Kit (KAPA Biosystems, США) в соответствии с протоколом производителя. Затем библиотеку разбавляли до 4 нМ и запускали на секвенаторе Illumina Desktop Sequencer с использованием набора реагентов с парными концами на 500 циклов (набор реагентов MiSeq, v2, MS-103-2003, Illumina Inc., Сан-Диего, Калифорния, США) при конечная концентрация 15 пМ с добавлением 25% PhiX control v3 (Illumina, FC-110-3001).

2.5. Биоинформатический и статистический анализ

Образцы были автоматически демультиплексированы с помощью программного обеспечения MiSeq на основе комбинаций их индексов. Данные последовательности были проанализированы с использованием ранее описанного биоинформатического конвейера (Авраменко и др. , 2017; Редман и др., 2019) на основе программного обеспечения Mothur версии 1.36.1 (Schloss и др., 2009). Вкратце, прямые и обратные последовательности были выровнены для создания контигов, которые были отфильтрованы для удаления прочтений короче 200 п.н. и длиннее 450 п.н. Остальные последовательности сравнили с созданной на заказ базой данных рДНК трихостронгилидной нематоды ITS-2 (Avramenko et al., 2017) и отфильтровали на минимальное сходство 90%. Затем последовательности были таксономически классифицированы с использованием метода k-ближайших соседей с k = 3. Дополнительные подробности и протоколы анализа можно найти на https://www.nemabiome.ca/mothur_workflow.html.

Образцы с общим числом прочтений менее 1000 были исключены из исследования. Подсчет классифицированных прочтений был скорректирован с учетом предвзятости репрезентации, характерной для вида, с использованием поправочных коэффициентов, ранее описанных и проверенных для желудочно-кишечных нематод овец (Redman et al. , 2019). Относительную численность каждого вида рассчитывали на основе общего количества прочтений последовательности из каждого образца.

Статистический анализ был выполнен на GraphPad Prism версии 8.1.0 для macOS, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com (подробности о проведенных тестах см. на рисунках). Альфа-разнообразие каждой выборки для исследования обилия видов было рассчитано с использованием обратного индекса Симпсона, выполненного в Mothur v.1.36.1. Все образцы были разделены на 1000 прочтений, чтобы обеспечить равное сравнение. Образцы, которые не соответствовали этому порогу, были удалены из этого анализа. Чтобы сравнить обратный индекс Симпсона между провинциями, мы выполнили однофакторный дисперсионный анализ в SPSS (IBM Corp. Выпущено в 2012 г. -Апостериорный сравнительный тест Хауэлла. Бета-разнообразие между обследованными популяциями оценивалось с помощью плагина MetaStats в Mothur v.1.36.1 с параметрами по умолчанию (White et al., 2009). ). P<0,05 считался значимым во всех проведенных тестах. Гистограммы и диаграммы рассеяния были созданы в программном обеспечении GraphPad. Карта, показанная в, была создана с использованием пакета rgdal (Bivand et al., 2019) в версии R studio 1.2.1335.

Открыть в отдельном окне

Метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 позволило провести исследование интенсивности заражения желудочно-кишечными нематодами в западной Канаде. Данные, показанные на панелях A, B и C, получены от 92 овец на основе подсчета фекальных яиц (модифицированный McMaster) и метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2, примененного к объединенным образцам от 20 овец на стадо, взятым в период с 2014 по 2018 год (7 ферм из Британской Колумбия, 55 ферм из Альберты, 18 ферм из Саскачевана и 12 ферм из Манитобы).

Панель A. Распределение интенсивности желудочно-кишечной нематодной инфекции у овец из стад овец в западной Канаде. г. до н.э. – Британская Колумбия, AB – Альберта, SK – Саскачеван, MB – Манитоба. Местоположение Калгари показано серой заштрихованной булавкой. Чтобы сохранить конфиденциальность данных, приблизительное местоположение каждой фермы на основе координат почтового отделения было преобразовано во фрейм данных Special Points и нанесено на график с использованием пакета rgdal в программном обеспечении RStudio версии 1.2.1335 с использованием файлов формы границ Канады, доступных в Статистическом управлении Канады. Количество яиц в фекалиях до обработки (яиц на грамм) определяли с помощью модифицированной методики Макмастера, а стада классифицировали в соответствии с количеством яиц в фекалиях на голубые (0–500 epg), оранжевые (501–2000 epg) и красные (2001–4000 epg) ).

Панель B. Относительная численность видов желудочно-кишечных нематод у овец из 92 стад западно-канадских овец, определенная подсчетом фекальных яиц и метабаркодированием немабиома рДНК ITS-2 в образцах до лечения . Количество фекальных яиц до обработки для каждого стада представлено в виде черных полос на верхней гистограмме. Относительный видовой состав (%), определяемый метабаркодированием немабиома рДНК ITS-2 не менее 200 личинок L ₁ в каждом образце до обработки и представлен нижними цветными столбиками, сложенными друг в друга. Расположение провинции указано под диаграммой (BC-Британская Колумбия, AB-Альберта, SK-Саскачеван, MB-Манитоба).

Панель C. Резюме численности видов желудочно-кишечных нематод у овец западно-канадского стада овец. Скрипичный график суммирует относительную численность различных видов желудочно-кишечных нематод в каждом из 92 стад овец, определяемую с помощью метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 образцов до обработки. Анализ бета-разнообразия выполнялся с помощью команды MetaStats в программном обеспечении mothur v.1.36.1. Численность 90 513 H. contortus была значительно выше по сравнению со всеми другими видами (а, р < 0,0001). 9Численность 0513 Teladorsagiacircincta и Trichostrongylus colubriformis значительно отличалась (b, p < 0,0001), чем у всех идентифицированных видов, за исключением друг друга .

3.1. Метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 выявляет высокую интенсивность желудочно-кишечной нематодной инфекции и преобладание

Всего в наборе данных было идентифицировано одиннадцать операционных таксономических единиц (OTU): Chabertia ovina , Oesophagostomum venulosum , Cooperia oncophora , Haemonchus contortus , Haemonchus placei , Ostertagia ostertagi , Teladorsagia circumcincta , Trichostrongylus axei , Trichostrongylus colubriformis , Trichostrongylus vitrinus and Trichostrongylus sp (неклассифицированный). Сначала мы исследовали интенсивность заражения различными видами желудочно-кишечных стронгилидных нематод у овец в течение 9 лет.2 стада овец в западной Канаде с использованием комбинации подсчета фекальных яиц и метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2. Количество фекальных яиц стронгил варьировало от 17 до 3915 epg (среднее 785, медиана 446, стандартное отклонение 864). Яйца ооцист Nematodirus sp, Trichuris sp и Moniezia sp, а также ооцист Eimeria встречались лишь изредка в небольшом количестве и в данной статье не обсуждаются.

Haemonchus contortus был самым распространенным видом стронгилидных нематод в целом (p < 0,0001, Крускал-Уоллис, затем множественное сравнение Данна) и был обнаружен во всех стадах, кроме 5, в Альберте. Teladorsagiacircinct a был следующим наиболее многочисленным видом, за которым следовал T. colubriformis. Численность Teladorsagiacircincta и T. colubriformis значительно отличалась (p<0,0001) от численности всех других идентифицированных видов (значения p варьировались от <0,0001 до>0,9999). Не было существенной разницы в численности между 90 513 T.circincta и T. colubriformis (p> 0,9999, B и C). Из 92 обследованных стад овец H. contortus, T.circincta и T. colubriformis были наиболее многочисленными видами в 69, 14 и 7 стадах соответственно. В двух стадах Trichostrongylus vitrinus был самым многочисленным видом (ферма 5 с 26% и ферма 90 с 50%, обе в AB). Другие виды, такие как Chabertia ovina , Oesophagostomum venulosum и Trichostrongylus axei , также имели высокую относительную численность в нескольких стадах (C). Существовала значительная разница в бета-разнообразии T. colubriformis между BC и AB (p = 0,02). В дополнительной таблице 6 показано сравнение бета-разнообразия H. contortus , T.circumcincta и T. colubriformis между провинциями.

3.2. Метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 как инструмент для оценки эффективности применяемой производителем антигельминтной обработки против определенных видов желудочно-кишечных нематод 56 отар западно-канадских овец. Количество фекальных яиц определяли в объединенных образцах, собранных производителями. Процентное снижение общего количества фекальных яиц стронгилов после лечения составило менее 95% в 32/32 стадах, 11/11 и 10/13 для ивермектина, фенбендазола и альбендазола соответственно (A, графики серой скрипки и дополнительный рисунок 1, верхние столбцы гистограммы).

Открыть в отдельном окне

Использование метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 для определения эффективности антигельминтных средств, применяемых производителем против определенных видов желудочно-кишечных нематод в западной Канаде.

Панель A. Уменьшение количества фекальных яиц после обработки, применяемой производителем, интерполировано на основе данных немабиома рДНК ITS-2 для определенных видов желудочно-кишечных нематод.

Относительная численность видов, определенная метабаркодированием немабиома рДНК ITS-2 в каждом образце до и после обработки, использовалась для интерполяции видового количества яиц и эффективности обработки для каждой группы в 56 образцах обработки, примененных производителем. Скрипичные графики показывают эффективность препарата, основанную на снижении общего количества фекальных яиц стронгильного типа (серые) и эффективности против Haemonchus contortus (розовый) , Teladorsagiacircumcincta (бирюзовый) и Trichostrongylus colubriformi s (оранжевый) для ивермектина, фенбендазола и альбендазола соответственно. Пунктирные линии представляют собой квартили, а сплошные линии представляют собой медиану каждого графика скрипки. Статистическую значимость различий между группами определяли по Краскелу-Уоллису с последующим тестом множественных сравнений Данна с использованием GraphPad Prism версии 8.1.0 для macOS, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com.

Панель B. Количество стад с субоптимальной эффективностью обработки, применяемой производителем. Каждая ячейка в таблице показывает количество стад с удельной эффективностью обработки ниже 95%/общее количество стад, протестированных с ивермектином, фенбендазолом и альбендазолом против Haemonchus contortus, Teladorsagiacircumcincta и Trichostrongylus colubriformis соответственно .

Мы использовали данные метабаркодирования рДНК ITS-2 немабиома до и после лечения, чтобы интерполировать видоспецифические значения количества фекальных яиц и процентное снижение количества фекальных яиц для каждого из трех основных видов GIN для применяемых производителем ивермектина, фенбендазола и лечение альбендазолом (A и B и дополнительная таблица 5A). Были включены все образцы с не менее чем 5% численностью каждого вида перед обработкой, что соответствует не менее 10 личинок в каждой объединенной пробе из 200 личинок или 25 в пробах, где использовалось 500 личинок, которые таксономически классифицируются как 9.0513 H. contortus , T.circincta, или T. colubriformis. В случае ивермектина эффективность применяемых производителем обработок была ниже 95% в 30/31 поголовье, 4/14 поголовья и 7/14 поголовья для H. contortus , T.circincta и T. colubriformis соответственно. В случае с фенбендазолом эффективность применяемых производителем обработок была ниже 95% в 11/11 стад, 1/8 стад и 4/8 стад для H. contortus , T.circincta и T.colubriformis соответственно. В случае с альбендазолом эффективность применяемых производителем обработок была ниже 95% в 10/13 стад, 2/9 стад и 2/8 стад для H. contortus , T.circincta и T. colubriformis соответственно (В).

Ивермектин был менее эффективен против H. contortus по сравнению с двумя другими видами (p<0,0001 и p<0,03 для T.circincta и T. colubriformis , соответственно, Крускала-Уоллиса с последующим тестом множественного сравнения Данна) (). Эффективность лечения фенбендазолом была значительно выше по сравнению с T.circincta по сравнению с H. contortus (p<0,0005) (). Эффективность лечения альбендазолом была значительно ниже по сравнению с H. contortus по сравнению с T.circumcincta (p<0,03) (). Общий средний процент эффективности стронгилов и стандартное отклонение этих препаратов по отношению к трем видам суммированы в A и B и в дополнительной таблице 5A. Другие виды нематод также присутствовали после обработки ивермектином и бензимидазолами в меньшем количестве, например, O. venulosum , T. vitrinus и T. axei (дополнительный рисунок 1).

3.3. Интеграция метабаркодирования рДНК немабиома ITS-2 и теста на снижение количества фекальных яиц (FECRT) для диагностики устойчивости к глистам

Мы исследовали наличие устойчивых к глистам желудочно-кишечных нематод трихостронгилид против нескольких различных антигельминтных препаратов, выполнив FECRT на образцах фекалий с посещенных ферм. Основываясь на критериях WAAVP, резистентность присутствует, если процентное снижение составляет менее <95%, а нижний 95% доверительный интервал меньше 90%. Доверительные интервалы были рассчитаны в соответствии с уравнением 1 в Levecke et al. (2018). Было установлено, что устойчивые к антигельминтным средствам нематоды стронгилида присутствуют против ивермектина, фенбендазола, моксидектина и левамизола в 10/13 стад, 9/13 стад, 0/6 стад и 1/4 стад соответственно (A и дополнительная рис. 2).

Открыть в отдельном окне

Интеграция метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 с формальными тестами на снижение числа яиц в фекалиях (FECRT) для исследования устойчивости к глистогонным средствам против определенных видов желудочно-кишечных нематод в западной Канаде.

Панель A. Данные о немабиоме рДНК ITS-2 для определенных видов желудочно-кишечных нематод. Относительная численность видов в каждом образце до и после обработки, определенная с помощью метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2, использовалась для интерполяции видового количества фекальных яиц и для демонстрации данных об эффективности лечения Тестом на снижение количества фекальных яиц для отдельных видов желудочно-кишечных нематод. Скрипичные графики показывают эффективность препарата, основанную на снижении общего количества фекальных яиц стронгильного типа (серые), и эффективность против Haemonchus contortus (розовый) , Teladorsagiacircumcincta (бирюзовый) и Trichostrongylus colubriformis (оранжевый) для ивермектина, фенбендазола, левамизола и моксидектина соответственно. Не все антигельминтные препараты были протестированы во всех хозяйствах. Пунктирные линии представляют собой квартили, а сплошные линии представляют собой медиану каждого графика скрипки. Статистическую значимость различий между группами определяли по Краскелу-Уоллису с последующим тестом множественных сравнений Данна с использованием GraphPad Prism версии 8.1.0 для macOS, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com.

Панель B. Количество стад с видовой эффективностью ниже 95% по данным теста на снижение числа яиц в фекальных массах (FECRT). Каждая ячейка в таблице показывает количество стад с эффективностью специфической обработки ниже 95%/общее количество стад, протестированных с ивермектином, фенбендазолом, левамизолом и моксидектином против Haemonchus contortus, Teladorsagiacircumcincta и Trichostrongylus colubriformis соответственно .

Мы использовали данные метабаркодирования рДНК немабиома ITS-2 из образцов FECRT до и после лечения, чтобы интерполировать видоспецифичное количество фекальных яиц и снижение количества фекальных яиц для H. contortus , T.circincta и T. colubriformis (A и B и дополнительная таблица 5B). Были включены все образцы с численностью не менее 5% каждого вида в ходе предварительной обработки, что соответствует не менее 10 личинок на каждые 200 личинок или 25 личинок на каждые 500 объединенных образцов личинок, которые таксономически классифицируются как H. contortus , . T.circincta, или T. colubriformis (в дополнительной таблице 3 показано количество личинок, включенных в каждый препарат лизата, образцы, не включенные в набор данных об эффективности конкретного лечения, отмечены знаком «*») . В случае применения ивермектина у 11/13 стад, 3/8 стад и 1/9 стад снижение числа фекальных яиц было менее 95% для H. contortus , T.circincta и T. colubriformis соответственно. В случае применения фенбендазола в 9/10 стад, 0/7 стад и 1/6 было отмечено снижение количества яиц в фекалиях менее чем на 95% для H. contortus , T.circincta и T. colubriformis соответственно. В случае левамизола 0/4 стад, 4/4 стад и 0/1 имели менее 95% снижение количества фекальных яиц для H. contortus , T.circumcincta и T. colubriformis соответственно. В случае с моксидектином ни в одном из стад не наблюдалось снижения числа фекальных яиц менее чем на 95% ни для одного из изученных видов (B). Эффективность лечения ивермектином была значительно выше (p < 0,0034, Kruskal-Wallis, с последующим тестом множественных сравнений Данна) против T. colubriformis по сравнению с H. contortus . Эффективность лечения фенбендазолом была значительно ниже по сравнению с H. contortus по сравнению с двумя другими видами (p < 0,01 и p = 0,009). Не было никакой разницы между эффективностью лечения левамизолом и моксидектином в отношении трех видов.

Мы также провели FECRT для клозантела на семи стадах (A и B). Основываясь на данных общего количества яиц в фекалиях, было отмечено снижение количества яиц в фекалиях <95% (<90% ниже 95% доверительного интервала) в 7/7 стадах. Мы использовали данные метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 из образцов FECRT до и после лечения из шести стад, чтобы интерполировать видоспецифичное количество фекальных яиц и снижение количества фекальных яиц для H. contortus , T.circincta , T. colubriformis и T. vitrinus . В 5/6 стадах наблюдалось снижение интерполированного количества яиц в фекалиях более чем на 95% для H. contortus (панели A и B) . В отличие от этого, 6/6 стад, 2/3 стад и 2/2 имели снижение количества фекальных яиц менее чем на 95% для T.circincta, T.colubriformis и T.vitrinus соответственно. Эффективность лечения клозантелом была значительно выше (p<0,047, тест Крускала-Уоллиса с последующим тестом множественных сравнений Данна) по сравнению с H. contortus по сравнению с T.circincta .

Открыть в отдельном окне

Интеграция метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 с формальным тестом на снижение количества фекальных яиц для изучения эффективности клозантела против определенных видов желудочно-кишечных нематод.

Панель A. Данные о подсчете яиц в кале и данные немабиома рДНК ITS-2 для тестов на снижение количества яиц в кале (FECRT), проведенных для оценки эффективности клозантела. Количество фекальных яиц до и после лечения, полученное в результате тестов на снижение количества фекальных яиц (FECRT), представлено в виде точечных диаграмм (серые). Отдельные точки представляют количество яиц отдельных животных в каждой группе до и после лечения. Серые столбцы представляют среднее количество яиц в каждой группе животных до и после лечения. Цифры над точечными диаграммами представляют собой общее процентное снижение количества фекальных яиц по сравнению с количеством яиц до и после лечения клозантелом, рассчитанное в соответствии с Levecke et al. (2018) (зеленый: чувствительный, красный: устойчивый). Относительный видовой состав (%) определяли с помощью метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 не менее 200 личинок первой стадии в каждом образце до и после обработки, представленных в нижних столбцах стопкой. Панель B. Данные теста на снижение количества яиц в кале (FECRT) для клозантела, интерполированные из данных немабиома рДНК ITS-2 для определенных видов желудочно-кишечных нематод.

Относительная численность видов в каждом образце до и после лечения, определенная с помощью метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2, использовалась для интерполяции видовоспецифического количества фекальных яиц и эффективности лечения для групп клозантела по данным теста на снижение количества фекальных яиц. Скрипичные графики показывают эффективность препарата, основанную на снижении общего количества яиц стронгильного типа (серые) и эффективности против Haemonchus contortus (розовый) , Teladorsagiacircumcincta (бирюзовый), Trichostrongylus colubriformis (оранжевый) и Trichostrongylus vitrinus (желтый) для клозантела. Пунктирные линии представляют собой квартили, а сплошные линии представляют собой медиану каждого графика скрипки. Статистическую значимость различий между группами определяли по Краскелу-Уоллису с последующим тестом множественных сравнений Данна с использованием GraphPad Prism версии 8. 1.0 для macOS, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com.

4.1. Метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 выявляет инфекции смешанных видов желудочно-кишечных нематод с преобладанием

На овцеводческих фермах в западной Канаде не было опубликованных данных о распространенности желудочно-кишечных видов, интенсивности инфекции и статусе устойчивости к глистам в течение более 15 лет, и только два небольших исследования были опубликованы за последние 40 лет. (Moteane et al., 1979; Colwell et al., 2002). За последние 10–15 лет увеличилось количество неподтвержденных сообщений от производителей овец и ветеринаров о клиническом гемонхозе, несмотря на широкое использование как ивермектина, так и бензимидазола. Следовательно, ситуация в западной Канаде предоставила нам возможность применить метабаркодирование немабиома рДНК ITS-2 для получения точной современной картины интенсивности инфекции и статуса устойчивости к антигельминтам конкретных видов GIN овец. Из 92 стада овец, обследованные в период с 2014 по 2018 г., интенсивность инфекции была высокой во многих стадах, при этом 44 стада (48%) имели FEC> 500 epg до лечения.

Haemonchus contortus, T.circincta и T. colubriformis были наиболее многочисленными видами со средней общей численностью 64%, 18% и 13% соответственно. Haemonchus contortus был видом с самой высокой интенсивностью инфекции в 69 стадах, T.circincta в 14 стадах и T. colubriformis в 7 стадах. Высокая интенсивность инфекции и преобладание H. contortus согласуются с частыми неподтвержденными сообщениями о клиническом гемонхозе, но резко контрастируют с ранее доступными данными. В двух предыдущих исследованиях, основанных на вскрытии, интенсивность инфекции H. contortus в целом была низкой, при этом преобладали роды Teladorsagia , Trichostrongylus и Nematodirus (Moteane et al., 19).79; Колвелл и др., 2002). H. contortus не сообщалось Colwell et al. (2002) и Moteane et al. (1979) сообщили лишь об очень низкой интенсивности инфекции со средним числом взрослых особей сычуга, равным 62 (диапазон 4–600). Хотя эти предыдущие исследования были небольшими, результаты подтверждают предположение о том, что за последние 15–20 лет распространенность H. contortus и интенсивность инфекции в регионе возросли. Высокая распространенность и интенсивность инфекции H. contortus , которые мы обнаружили в западной Канаде, аналогичны недавним исследованиям в других регионах с умеренным климатом и холодными зимами, таких как восточная Канада (Barrère et al., 2013; Falzon et al., 2013). Способность H. contortus процветать в этих регионах, несмотря на то, что изначально он был тропическим/субтропическим паразитом (O’Connor et al., 2006), вероятно, из-за его способности претерпевать остановку личиночного развития и выживать внутри хозяина во время холодные сухие зимы (Waller et al., 2004, 2006; O’Connor et al. , 2006; Abbott et al., 2012; Falzon et al., 2014; Westers et al., 2016). Причина увеличения числа H. contortus в западной Канаде за последние 15–20 лет может быть связана с несколькими факторами, включая интродукцию и распространение импортированными овцами, устойчивость к антигельминтам, нарушающую контроль, и изменение климата. Для определения относительной важности этих и других факторов потребуются дальнейшие исследования.

Хотя H. contortus оказался преобладающим видом в западной Канаде, T.circincta и T. colubriformis также присутствовали в относительно высокой численности в нескольких стадах в этом регионе. Это говорит о том, что следует также учитывать риск диарейных заболеваний, связанных с паразитарным гастроэнтеритом. Стоит сопоставить эти результаты с предыдущим исследованием в восточной Канаде, где H. contortus составляли более 80% видовой численности в 18/18 стадах перед антигельминтной обработкой (Falzon et al. , 2013). Будь то более высокие уровни T.circincta и T. colubriformis отражают региональные различия в обилии видов или просто различные методологические стратегии или стратегии отбора проб, которые еще предстоит определить.

4.2. Интеграция метабаркодирования рДНК немабиома ITS-2 с тестированием на снижение количества яиц в фекалиях показывает, что устойчивость к бензимидазолу и ивермектину широко распространена у

Как тестирование эффективности антигельминтного лечения, применяемое производителем, так и официальное тестирование на снижение числа яиц в фекалиях (FECRT) показывают, что резистентность к ивермектину и бензимидазолу широко распространена среди видов стронгилидных нематод в западной Канаде. Интеграция метабаркодирования рДНК ITS-2 с этими методами предоставила дополнительный уровень информации, показывающий, что устойчивость к обоим этим препаратам практически повсеместна у H. contortus , но все еще относительно редка для двух вторых наиболее важных видов паразитов GIN T.circincta и T.colubriformis . Необходима осторожность при интерпретации результатов снижения количества яиц в фекалиях в результате антигельминтной обработки, применяемой производителем, поскольку обработка может быть неоптимальной не только из-за устойчивости к глистогонным препаратам, но и из-за других факторов, таких как неправильное дозирование животных, использование просроченного препарата, невозможность сбора образцов от одних и тех же животных и другие факторы. Тем не менее, интересно отметить, что при сравнении двух наборов данных не было статистически значимой разницы между средними процентными значениями снижения количества яиц в фекалиях для общего количества яиц стронгилов или видово-специфическим интерполированным числом яиц. Это свидетельствует о том, что отсутствие эффективности в большем наборе данных об обработках, применяемых производителями (56 ферм), в основном связано с устойчивостью к антигельминтам, а не с другими методологическими факторами. Это, в свою очередь, предполагает, что резистентность к ивермектину и фенбендазолу у H. contortus действительно широко распространены в регионе. Тем не менее, существует общая тенденция к тому, что среднее снижение количества яиц в фекалиях оказывается ниже при лечении, применяемом производителем, по сравнению с данными FECRT, поэтому при интерпретации деталей данных о лечении, примененном производителем, по-прежнему необходима осторожность (1).

Открыть в отдельном окне

Сравнение эффективности лечения, применяемого производителем, и данных теста на снижение числа яиц в кале. Относительная численность видов, определенная с помощью метабаркодирования рДНК немабиома ITS-2 в каждом образце до и после обработки, использовалась для интерполяции видоспецифического сокращения количества фекальных яиц на Haemonchus contortus (розовый), Teladorsagiacircumcincta (бирюзовый) и Trichostrongylus colubriformis (оранжевый) , в стадах, применяемых производителем, и в тесте на снижение числа яиц в фекалиях, для лечения как бензимидазолом, так и ивермектином. Сплошные линии представляют собой среднее снижение количества фекальных яиц, красные пунктирные линии отмечают пороговое значение 95%. Статистическую значимость различий между группами определяли по Краскелу-Уоллису с последующим тестом множественных сравнений Данна с использованием GraphPad Prism версии 8.1.0 для macOS, GraphPad Software, Сан-Диего, Калифорния, США, www.graphpad.com. (Для интерпретации ссылок на цвет в легенде к этому рисунку читатель может обратиться к веб-версии этой статьи.)

Широко распространенная и во многих случаях высокая степень резистентности как к ивермектину, так и к бензимидазолу у H. contortus является интересной и тревожной, учитывая характер применения антигельминтных средств в западной Канаде. Хотя эти два класса препаратов являются основой борьбы с паразитами овец в западной Канаде более 30 лет, ивермектин является единственным лицензированным антигельминтным средством для овец в Канаде, в то время как фенбендазол и альбендазол лицензированы для использования у крупного рогатого скота и часто -этикетка (дополнительная таблица 1). Кроме того, большинство производителей лечат овец и ягнят только один раз в год, и все же обнаруженные нами уровни резистентности столь же высоки или даже выше, чем во многих странах с более частым применением антигельминтных средств. Например, в исследовании Соединенного Королевства, опубликованном в 2012 г. из 188 обследованных ферм, только у 22 была подтверждена устойчивость к антигельминтным средствам, и ни у одной из них не было устойчивости к ивермектину (Burgess et al., 2012). Существует ряд потенциальных причин такого высокого уровня резистентности к бензимидазолу и ивермектину в западной Канаде, несмотря на лечение овец и ягнят в основном один раз в год. С H. contortus не зимует на пастбищах в регионах с холодными зимами, ранняя весна — это время, когда большая часть популяции паразита находится внутри хозяина, а рефугиумов мало (Waller et al., 2004; Troell et al., 2005). ; Grosz et al., 2013; Falzon et al., 2014). Ранее было показано, что лечение во время окота связано с высоким избирательным давлением в Великобритании (Leathwick et al. , 1995). Это особенно актуально, когда все стадо лечится антигельминтными препаратами одновременно, что довольно распространено в западной Канаде. Роль низких рефугиумов при ранневесенних обработках овец также может, по крайней мере частично, объяснить, почему устойчивость к глистам менее развита у овец.0513 T.circincta и T.colubriformis , чем H. contortus . Было показано, что первые два паразита в некоторой степени зимуют на пастбищах в восточной Канаде, что увеличивает количество убежищ и снижает отбор (Falzon et al., 2014). Существует также ряд других потенциальных факторов риска, имеющих отношение к стадам западно-канадских овец, включая перемещение животных и ввоз поголовья из таких мест, как Соединенные Штаты, где высок уровень устойчивости как к бензимидазолу, так и к ивермектину в H. contortus , а также отсутствие строгих карантинных процедур для недавно завезенных животных. Это обсуждение подчеркивает, что факторы, влияющие на устойчивость к антигельминтам, гораздо сложнее, чем просто частота антигельминтного лечения (Learmount et al. , 2016b).

4.3. Интеграция метабаркодирования немабиома рДНК ITS-2 с тестом на снижение количества фекальных яиц для оценки устойчивости к моксидектину, левамизолу и клозантелу в западной Канаде

Учитывая высокий уровень устойчивости к препаратам ивермектин и бензимидазол в H. contortus и появление устойчивости у T.circincta и T. colubriformis в западной Канаде, необходимо разумно использовать другие препараты, к которым резистентность встречается реже. Следовательно, мы также использовали метабаркодирование FECRT/nemabiome для оценки устойчивости к нескольким другим антигельминтным средствам, которые реже используются в западной Канаде. Моксидектин широко используется в Соединенных Штатах, но на сегодняшний день в меньшей степени в западной Канаде. Мы обнаружили, что моксидектин очень эффективен против всех основных видов трихостронгилид, присутствующих во всех четырех стадах, в которых он был испытан (). Мы обнаружили, что эффективность левамизола, основанная на общем количестве фекальных яиц, была высокой для всех четырех исследованных стад. Однако, несмотря на то, что видоспецифичное снижение количества яиц в фекалиях, интерполированное на основе данных о немабиоме, указывает на высокую эффективность против H. contortus, эффективность против T.circincta была менее 95% на всех четырех стадах. Хотя общее снижение количества фекальных яиц стронгилов составило 93%, 99%, 96% и 96% (дополнительная таблица 5), интерполированная эффективность для T.circincta составила только 69%, 92%, 85% и 94% эффективности. Первоначально сообщалось, что левамизол обладает высокой эффективностью как против H. contortus , так и против T.circincta, в том числе против ингибированных личинок L4 (McKenna, 19).74; Andrews, 2000), и поэтому эта субоптимальная эффективность, особенно против T.circincta , может свидетельствовать о раннем появлении резистентности у этого вида. Свидетельства устойчивости штамма T.circumcincta к левамизолу были обнаружены у штамма T.circumcincta из многих стран, включая Грецию, Новую Зеландию, Бразилию, Ирландию и Испанию (Cezar et al. , 2010; Martínez-Valladares et al., 2012). ; Geurden et al., 2014; Keegan et al., 2015; Leathwick et al., 2015). Левамизол был лицензирован для использования у овец в Канаде до 2005 года и до сих пор в некоторой степени используется в восточной части Канады, поэтому произошел некоторый выбор препаратов с левамизолом. Интеграция метабаркодирования немабиома ITS-2 в FECRT предполагает раннее появление устойчивости к левамизолу у T.circincta , который не был обнаружен как общая потеря эффективности только в данных FECRT. Секвенирование рода T.circincta acr- 8 из этих и других популяций может помочь подтвердить устойчивость к левамизолу и отслеживать дальнейшее развитие.

В 2016 году клозантел (Flukiver©) был лицензирован для овец в Канаде, что является важным новым средством борьбы с паразитами. Эффективность этого препарата, основанная на данных FECRT на овцеводческих фермах Западной Канады, варьировалась от 0% до 89%.%. Поскольку спектр активности этого препарата ограничен кровососущими паразитами, такими как H. contortus, , невозможно оценить, связана ли эта переменная эффективность с резистентностью к клозантелу, с помощью FECRT, основанного только на общем подсчете яиц стронгилов, поскольку многие ферм включает инфекции смешанных видов. Интеграция данных немабиома рДНК ITS-2 показала, что препарат все еще был высокоэффективен против паразита-мишени H. contortus во всех случаях, а очевидная низкая эффективность была обусловлена ​​узким спектром действия препарата и смешанным видовым составом. паразитарных сообществ. Это является хорошей иллюстрацией того, как интеграция метабаркодирования немабиома в FECRT может предоставить важную информацию для диагностики и подтверждения устойчивости к антигельминтам.

Эта работа иллюстрирует возможности интеграции метабаркодирования рДНК ITS-2 немабиома как в рутинное тестирование эффективности подсчета фекальных яиц до и после лечения, так и в тест на снижение количества фекальных яиц (FECRT). Примером преимущества является то, как подход показал, что устойчивость к бензимидазолу и ивермектину находится на поздней стадии у H. contortus , но на гораздо более ранней стадии у T.circincta и T. colubriformis в западной Канаде. Это открывает возможность более целенаправленного использования этих старых препаратов, в то же время оставляя более новые, часто более дорогие препараты, для тех случаев, когда они особенно необходимы. Например, эффективные результаты лечения могут быть достигнуты на одних фермах только клозантелом, а на других фермах комбинацией клозантела с фенбендазолом или ивермектином. Однако на некоторых фермах потребуются другие препараты, такие как моксидектин или абамектин/дерквантел. Тестирование устойчивости к глистогонным препаратам с усиленным метабаркодированием Nemabiome может быть использовано для управления таким рациональным выбором лекарств способом, который невозможен только при тестировании эффективности на основе подсчета фекальных яиц. Метабаркодирование немабиома ITS-2 также выявило доказательства раннего появления резистентности к левамизолу у 9 пациентов. 0513 T.circincta , который не был обнаружен только по данным FECRT . Это также позволило оценить состояние резистентности к клозантелу, что снова было невозможно с использованием FECRT, основанного только на общем количестве фекальных яиц. Достоинства немабиомного метабаркодирования по сравнению с другими методами, используемыми для количественной оценки относительной численности видов, подробно обсуждались в другом месте (Авраменко и др., 2015, 2017; Редман и др., 2019). Важными ключевыми преимуществами являются более высокая точность (присвоение уровня видов), гибкость (нет необходимости предвидеть присутствующие виды или иметь предварительно проверенные протоколы для каждого отдельного вида) и его масштабируемость для крупных проектов наблюдения и исследований. В настоящее время основным ограничением для рутинного диагностического использования на отдельных фермах является необходимость группировать большое количество образцов в одном цикле секвенирования, чтобы сделать стоимость одного образца экономически оправданной. Несмотря на это ограничение, этот подход имеет значительный потенциал для рутинного диагностического использования в более крупных диагностических учреждениях, обрабатывающих большое количество образцов. Кроме того, платформы секвенирования и стоимость быстро меняются, поэтому мы предполагаем, что методология метабаркодирования немабиома будет продолжать развиваться для более гибкого использования в меньшем масштабе в будущем.

Мы благодарим летних студентов Аманду Кузык, Амелию Уайтлоу, Колби Моррис, Элспет Йейтс, Эмили Дори, Эрику Уорд, Эрику Брэндсон, Джеффа Лиса, Джесси Павлака и Кили Хейт, а также лаборанта Бруну Палмейру за помощь в сборе и обработке образцов. . Мы также благодарим преданных своему делу производителей овец, которые вызвались участвовать в этом проекте. Эта работа была поддержана стипендией Alberta Innovates Technology Futures (CQ), грантом NSERC Discovery RGPIN-2015-03976 (JSG) и грантами Alberta Agriculture and Forestry (AAF) 2015R029.R и 2017R021R (JSG и ML), Университет Калгари, Канада, программа обучения выпускников NSERC-CREATE Host-Parasite Interactions (HPI) и Летняя исследовательская программа бакалавриата факультета ветеринарной медицины (SURE). Большое спасибо Бренту Вагнеру из Университета Саскачевана за техническую поддержку.

^{Приложение A} Дополнительные данные к этой статье можно найти в Интернете по адресу https://doi.org/10.1016/j.ijpddr.2020.09.003.

Дополнительные данные к этой статье:

Мультимедийный компонент 1:

Щелкните здесь для просмотра. ^{(1.4M, docx)} Мультимедийный компонент 1

• Abbott K., Taylor M., Stubbbings L. a. Устойчивые стратегии борьбы с гельминтами для овец — техническое руководство для ветеринарных хирургов и консультантов. Прицелы. 2012: 27–32. [Google Scholar]
• Альварес-Санчес М.А., Перес-Гарсия Х., Крус-Рохо М.А., Рохо-Васкес Ф.А. ПЦР в реальном времени для диагностики устойчивости к бензимидазолу у трихостронгилид овец. Вет. Паразитол. 2005;129: 291–298. doi: 10.1016/j.vetpar.2005.02.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Amarante A.F.T. Почему важно правильно идентифицировать виды Haemonchus? Преподобный Брас. Паразитол. Вет. 2011;20:263–268. [PubMed] [Google Scholar]
• Эндрюс С.Дж. Эффективность левамизола и смеси оксфендазола и левамизола в отношении задержанных стадий устойчивых к бензимидазолу Haemonchus contortus и Ostertagiacircincta у овец. Вет. Паразитол. 2000; 88: 139–146. doi: 10.1016/S0304-4017(99)00195-8. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Авраменко Р.В., Брас А., Редман Э.М., Вудбери М.Р., Вагнер Б., Шури Т., Личчоли С., Виндейер М.С., Гиллеард Дж.С. Высокое видовое разнообразие сообществ трихостронгильных паразитов внутри и между стадами западноканадских коммерческих и природоохранных бизонов, выявленное с помощью метабаркодирования немабиома. Векторы паразитов. 2018; 11:1–13. doi: 10.1186/s13071-018-2880-y. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Авраменко Р.В., Редман Э.М., Льюис Р., Бишютт М.А., Палмейра Б.М., Язвинский Т.А., Жильярд Дж.С. Использование метабаркодирования немабиома для изучения разнообразия видов желудочно-кишечных нематод и эффективности антигельминтной обработки телят. Междунар. Дж. Паразитол. 2017;47:893–902. doi: 10.1016/j.ijpara.2017.06.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Авраменко Р.В., Редман Э.М., Льюис Р., Язвинский Т.А., Васмут Дж.Д., Жильярд Дж.С. Изучение желудочно-кишечного «немабиома»: глубокое секвенирование ампликонов для количественной оценки видового состава сообществ паразитических нематод. PloS Один. 2015; 10:1–18. doi: 10.1371/journal.pone.0143559. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Barone C.D., Wit J., Hoberg EP, Gilleard J.S., Zarlenga DS. Дикие жвачные животные как резервуары желудочно-кишечных нематод домашнего скота. Вет. Паразитол. 2020;279doi: 10.1016/j.vetpar.2020.109041. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Баррер В., Фальзон Л.С., Шакья К.П., Мензис П.И., Перегрин А.С., Причард Р.К. Оценка устойчивости Haemonchus contortus к бензимидазолу в стадах овец в Онтарио, Канада: сравнение методов обнаружения лекарственной устойчивости. Вет. Паразитол. 2013; 198:159–165. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.07.040. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Биванд Р., Кейтт Т., Роулингсон Б. Библиотека абстракций; 2019. Ргдал: привязки к «геопространственным» данным. [Академия Google]
• Burgess C.G.S., Bartley Y., Redman E., Skuce P.J., Nath M., Whitelaw F., Tait A., Gilleard J.S., Jackson F. Обзор видов нематод трихостронгилид, присутствующих на овцеводческих фермах Великобритании, и связанный с ними антигельминтный контроль практики. Вет. Паразитол. 2012; 189: 299–307. doi: 10.1016/j.vetpar.2012.04.009. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Чернянска Д., Варади М., Чорба Я. Исследование устойчивости нематодозных паразитов овец к глистогонным препаратам в Словацкой Республике. Вет. Паразитол. 2006;135:39–45. doi: 10.1016/j.vetpar.2005.09.001. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Cezar A.S., Toscan G., Camillo G., Sangioni L.A., Ribas H.O., Vogel F.S.F. Множественная резистентность желудочно-кишечных нематод к девяти различным препаратам в стаде овец на юге Бразилии. Вет. Паразитол. 2010; 173:157–160. doi: 10.1016/j.vetpar.2010.06.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Чандра С., Прасад А., Санкар М., Ядав Н., Далал С. Молекулярная диагностика устойчивости к бензимидазолу у Haemonchus contortus у овец из разных географических регионов Северной Индии. Вет. 2014;7:337–341. doi: 10.14202/vetworld.2014.337-341. Мир. [Перекрестная ссылка] [Академия Google]
• Чандраватани П., Уоллер П.Дж., Аднан М., Хеглунд Дж. Эволюция высокого уровня множественной устойчивости к глистогонным средствам на овцеводческой ферме в Малайзии. Троп. Аним. Здоровье Прод. 2003; 35:17–25. [PubMed] [Google Scholar]
• Coles G.C., Bauer C., Borgsteede F.H.M., Geerts S., Klei T.R., Taylor M.A., Waller P.J. Методы Всемирной ассоциации развития ветеринарной паразитологии (W.A.A.V.P.) для выявления антигельминтной резистентности у нематоды ветеринарного значения. Вет. Паразитол. 1992;44:35–44. doi: 10.1016/0304-4017(92)
  -U. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Coles G. C., Jackson F., Pomroy W.E., Prichard R.K., von Samson-Himmelstjerna G., Silvestre A., Taylor MA, Vercruysse J. Обнаружение антигельминтной резистентности у нематод ветеринарное значение. Вет. Паразитол. 2006; 136: 167–185. doi: 10.1016/j.vetpar.2005.11.019. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Colwell D.D., Goater C.P., Jacobson K.M. Распространенность и интенсивность желудочно-кишечных нематод у ягнят на бойне из центральной Альберты. Может. Вет. J. = La Rev. Vet. Может. 2002; 43: 775–777. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Домке А.В.М., Шартье С., Гьерде Б., Хеглунд Дж., Лейне Н., Ватн С., Стьен С. Распространенность резистентности к антигельминтам у желудочно-кишечных нематод овец и коз в Норвегии. Паразитол. Рез. 2012; 111:185–193. doi: 10.1007/s00436-012-2817-x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Drudge JH, Szanto J., Wyant Z.N., Elam G. Полевые исследования по борьбе с паразитами у овец: сравнение тиабендазола, руэлена и фенотиазина. Являюсь. Дж. Вет. Рез. 1964; 25: 1512–1518. [PubMed] [Академия Google]
• Elmahalawy S.T., Halvarsson P., Skarin M., Höglund J. Капельная цифровая полимеразная цепная реакция (ddPCR) как новый метод абсолютного количественного определения основных желудочно-кишечных нематод у овец. Вет. Паразитол. 2018; 261:1–8. doi: 10.1016/j.vetpar.2018.07.008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Фальзон Л.К., Мензис П.И., Шакья К.П., Джонс-Биттон А., Ванлеувен Дж., Авула Дж., Стюарт Х., Янсен Дж.Т., Тейлор М.А., Лермаунт Дж., Перегрин КАК. Антигельминтная резистентность овец в Онтарио, Канада. Вет. Паразитол. 2013;193: 150–162. doi: 10.1016/j.vetpar.2012.11.014. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Falzon L.C., Menzies P.I., VanLeeuwen J., Shakya K.P., Jones-Bitton A., Avula J., Jansen J.T., Peregrine A.S. Пилотный проект по изучению зимовки свободноживущих личинок желудочно-кишечных нематод овец в Онтарио, Канада. Может. Вет. Дж. 2014; 55:749–756. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• Гарсия С. М.Б., Шпренгер Л.К., Ортис Э.Б., Моленто М.Б. Первое сообщение о множественной резистентности к антигельминтным средствам у нематод овец в Колумбии. Ан. акад. Бюстгальтеры. Cиенц. 2016;88:397–402. doi: 10.1590/0001-3765201620140360. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гассер Р. Б., Ботт Н. Дж., Чилтон Н. Б., Хант П., Беверидж И. На пути к практическим методам диагностики паразитических нематод домашнего скота на основе ДНК — биономические и биотехнологические последствия. Биотехнолог. Доп. 2008; 26: 325–334. doi: 10.1016/j.biotechadv.2008.03.003. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Герден Т., Хосте Х., Жаки П., Траверса Д., Сотираки С., Франгипане ди Регальбоно А., Цанидакис Н., Костопулу Д., Гайак К., Приват С., Джангасперо А., Занарделло К., Ноэ Л., Ванимисетти Б., Бартрам Д. Устойчивость к глистам и множественная лекарственная устойчивость нематод желудочно-кишечного тракта овец во Франции, Греции и Италии. Вет. Паразитол. 2014;201:59–66. doi: 10.1016/j.vetpar. 2014.01.016. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Гросс Д.Д., Эльяки А.А., Холлер Л.Д., Петерсен Д.Дж., Холлер С.В., Хилдрет М.Б. Стратегии перезимовки популяции устойчивых к антигельминтам Haemonchus contortus в стаде овец с севера Великих равнин США. Вет. Паразитол. 2013; 196: 143–152. doi: 10.1016/j.vetpar.2013.01.026. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Киган Дж. Д., Кин О. М., Фаррелл Л., Бирн В., Де Ваал Т., Гуд Б. Характеристика ивермектина и множественной лекарственной устойчивости двух полевых изолятов Teladorsagiacircincta из Отары ирландских овец. Вет. Паразитол. Рег. Стад. Отчеты. 2015;1(2):3–9. doi: 10.1016/j.vprsr.2016.03.005. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Learmount J., Stephens N., Boughtflower V., Barrecheguren A., Rickell K. Развитие устойчивости к глистогонным препаратам с помощью передовой практики борьбы с нематодами на коммерческих овцеводческих фермах в Великобритании. Вет. Паразитол. 2016; 229:9–14. doi: 10.1016/j.vetpar.2016. 09.006. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Learmount J., Stephens N., Boughtflower V., Barrecheguren A., Rickell K., Massei G., Taylor M. Трехлетняя оценка руководящих принципов передовой практики по борьбе с нематодами на коммерческих овцеводческих фермах в Великобритании. Вет. Паразитол. 2016; 226:116–123. [PubMed] [Академия Google]
• Литвик Д.М., Ганеш С., Вагхорн Т.С. Доказательства возврата к антигельминтной чувствительности у Teladorsagiacircincta в ответ на программы управления резистентностью. Междунар. Дж. Паразитол. Наркотики Устойчивость к наркотикам. 2015;5:9–15. doi: 10.1016/j.ijpddr.2015.01.001. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Leathwick DM, Vlassofft A., Agriculture F.H., Zealand N., Animal W., Hutt U., Zealand N., Agriculture C., Center S. , Бэг П., Зеландия Н. Модель нематодоза у новозеландских ягнят: влияние режима обливания и выпаса на развитие устойчивости к глистогонным средствам. Междунар. Дж. Паразитол. 1995;25:1479–1490. [PubMed] [Google Scholar]
• Левеке Б., Каплан Р.М., Тамсборг С.М., Торгерсон П.Р., Веркруйсс Дж., Добсон Р.Дж. Как улучшить стандартизацию и диагностическую эффективность теста на снижение количества яиц в кале? Вет. Паразитол. 2018; 253:71–78. doi: 10.1016/j.vetpar.2018.02.004. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Lichtenfels J.R., Pilitt P.A. Синломорфные закономерности гемонхинов жвачных (нематоды: трихостронгилоиды) J. Parasitol. 2000;86:1093. дои: 10.2307/3284828. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Люнгстрём С., Мелвилл Л., Скуче П.Дж., Хеглунд Дж. Сравнение четырех диагностических методов обнаружения и относительного количественного определения яиц Haemonchus contortus в образцах фекалий. Передний. Вет. науч. 2018;4 doi: 10.3389/fvets.2017.00239. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Линдал-Мерфи М., Эрлих В., Майер Д. Устойчивость к глистным гельминтам у овечьих желудочно-кишечных нематод во внутренних районах южного Квинсленда. Ауст. Вет. Дж. 2014; 92: 415–420. doi: 10.1111/avj.12250. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Мартинес-Валладарес М., Фамуларо М.Р., Фернандес-Пато Н., Кордеро-Перес С., Кастаньон-Ордоньес Л., Рохо-Васкес Ф.А. Характеристика изолята Teladorsagiacircincta с множественной лекарственной устойчивостью из Испании. Паразитол. Рез. 2012;110:2083–2087. doi: 10.1007/s00436-011-2753-1. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• McKenna P.B. Антигельминтная эффективность тиабендазола и левамизола в отношении ингибированных личинок Haemonchus contortus у овец. NZ Vet. Дж. 1974; 22: 163–166. дои: 10.1080/00480169.1974.34157. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• McMurtry L.W., Donaghy M.J., Vlassoff A., Douch P.G.C. Отличительные морфологические признаки третьей личиночной стадии овец Trichostrongylus spp. Вет. Паразитол. 2000;90:73–81. doi: 10.1016/S0304-4017(00)00230-2. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Mes T.H.M., Eysker M., Ploeger H.W. Простой, надежный и полуавтоматический протокол выделения яиц паразитов. Нац. протокол 2007; 2: 486–489. doi: 10.1038/nprot.2007.56. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Мильхес М., Гильерм М., Робин М., Эйхштадт М., Рой К., Гризе К., Прево Ф., Льенар Э., Бухсира Э., Франк М., Жаки П. ПЦР в реальном времени подход к выявлению устойчивых к антигельминтным средствам нематод на овцеводческих фермах. Паразитол. Рез. 2017; 116: 909–920. doi: 10.1007/s00436-016-5364-z. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Mitchell CJ, O’Sullivan C.M., Pinloche E., Wilkinson T., Morphew R.M., McEwan N.R. Использование секвенирования следующего поколения для определения разнообразия кишечных червей лошадей: идентификация конского ʼnemabiome’ J. Equine Sci. 2019;30:1–5. doi: 10.1294/jes.30.1. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Moteane M., Middleton D.M., Polley L.R. Обзор заболеваний взрослых и откормочных овец в Саскачеване. Может. Вет. Дж. 1979; 20: 2–7. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]
• О’Коннор Л. Дж., Уокден-Браун С.В., Кан Л.П. Экология свободноживущих стадий основных трихостронгилидных паразитов овец. Вет. Паразитол. 2006; 142:1–15. doi: 10.1016/j.vetpar.2006.08.035. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Пападопулос Э., Галлидис Э., Птохос С. Антигельминтная резистентность овец в Европе: избранный обзор. Вет. Паразитол. 2012; 189:85–88. doi: 10.1016/j.vetpar.2012.03.036. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Ploeger H.W., Everts RR. Тревожные уровни устойчивости к глистогонным средствам против желудочно-кишечных нематод у овец в Нидерландах. Вет. Паразитол. 2018; 262:11–15. doi: 10.1016/j.vetpar.2018.09.007. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Redman E., Queiroz C., Bartley D.J., Levy M., Avramenko R.W., Gilleard J.S. Валидация секвенирования немабиома рДНК ITS-2 для желудочно-кишечных нематод овец и его применение в крупномасштабном обследовании овцеводческих ферм Великобритании. Вет. Паразитол. 2019;275:108933. doi: 10.1016/j.vetpar.2019.108933. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Робер Ф., Джекс А.Р., Кэмпбелл А.Дж.Д., Кэмпбелл Б.Е., Андерсон Г.А., Гассер Р.Б. Оценка и применение молекулярного метода для оценки состава популяций стронгилидных нематод у овец с естественным путем инфекции. Заразить. Жене. Эвол. 2011; 11: 849–854. doi: 10.1016/j.meegid.2011.01.013. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Roeber F., Morrison A., Casaert S., Smith L., Claerebout E., Skuce P. Мультиплексная тандемная ПЦР для специфической диагностики желудочно-кишечных нематодозных инфекций у овец: европейское валидационное исследование. Векторы паразитов. 2017;10:226. doi: 10.1186/s13071-017-2165-x. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Роуз Х., Ринальди Л., Боско А., Маврот Ф., де Ваал Т., Скьюс П., Шарлье Дж., Торгерсон П.Р., Герцберг Х., Хендриккс Г., Веркруйсс Дж., Морган Э.Р. Широко распространенный антигельминтный препарат резистентность у европейских жвачных животных, выращиваемых на фермах: систематический обзор. Вет. Рек. 2015;176:546. doi: 10.1136/vr.102982. 546. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Salgado J.A., Santos C. de P. Обзор устойчивости желудочно-кишечных нематод мелких жвачных к антигельминтным средствам в Бразилии. Преподобный Брас. Паразитол. Вет. 2016; 25:3–17. дои: 10.1590/s1984-29612016008. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Schloss P.D., Westcott S.L., Ryabin T., Hall J.R., Hartmann M., Hollister E.B., Lesniewski R.A., Oakley B.B., Parks D.H., Robinson CJ, Sahl J.W., Stres B. , Таллинджер Г.Г., Ван Хорн Д.Дж., Вебер К.Ф. Представляем mothur: открытое, независимое от платформы, поддерживаемое сообществом программное обеспечение для описания и сравнения микробных сообществ. заявл. Окружающая среда. микробиол. 2009; 75:7537–7541. doi: 10.1128/AEM.01541-09. [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Смил М.Г., Гоф П.А., Джексон А.Р., Хотсон И.К. Возникновение штаммов Haemonchus contortus, устойчивых к тиабендазолу. Ауст. Вет. Дж. 1968; 44: 108–109. doi: 10.1111/j.1751-0813.1968.tb09033.x. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Troell K., Waller P., Höglund J. Развитие и выживание свободноживущих личинок Haemonchus contortus во время зимовки в Швеции. Дж. Гельминтол. 2005; 79: 373–379. doi: 10.1079/joh3005286. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Ван Вик Дж. А., Кабаре Дж., Майкл Л. М. Упрощенная морфологическая идентификация личинок нематод мелких жвачных и крупного рогатого скота. Вет. Паразитол. 2004; 119: 277–306. doi: 10.1016/j.vetpar.2003.11.012. [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]
• Waller P.J., Rudby-Martin L., Ljungström B.L., Rydzik A. Эпидемиология сычужных нематод овец в Швеции с особым упором на стратегии выживания в зимний период. Вет. Паразитол. 2004; 122: 207–220. doi: 10.1016/j.vetpar.2004.04.007. [PubMed] [CrossRef] [Академия Google]
• Waller P.J., Rydzik A., Ljungström B.L., Törnquist M. К искоренению Haemonchus contortus в стадах овец в Швеции. Вет. Паразитол.

  No related posts.